上交朱家全/崔文国Small封面:外泌体-水凝胶促进子宫内膜再生，生育能力恢复和后代的活产|exo|peg|子宫|细胞|血管

【科研摘要】

子宫内膜变薄是胚胎移植失败的主要原因，导致长期不孕和阴性家庭结局。尽管激素治疗对某些妇女而言大大提高了生育能力，但由于复杂的子宫内膜微环境的损伤和感染，这些反应仍然不能令人满意。最近，上海交通大学朱家全/崔文国教授团队通过多功能微环境保护的外泌体-水凝胶旨在通过原位显微注射和子宫内膜再生促进子宫内膜再生和生育力恢复。这种外泌体水凝胶是通过Ag+-S动态配位并与脂肪干细胞衍生的外泌体（ADSC-exo）融合而配制的，产生的注射剂足以减轻感染风险，同时还具有ADSC的抗原成分和旁分泌信号传导活性源细胞，使子宫内膜微环境再生。在体外，这种外泌体水凝胶发挥出色的新血管生成促进作用，增加人脐静脉内皮细胞的增殖和管形成，分别为1.87和2.2倍。在体内，微环境保护的外来体水凝胶还显示出促进新血管形成和组织再生，同时抑制局部组织纤维化。重要的是，再生的子宫内膜组织更容易接受胚胎的孕育并生出健康的新生儿。这种微环境保护的外泌体水凝胶系统提供了一种方便，安全且无创的方法来修复子宫内膜薄弱和生育能力恢复。相关论文以题为Microenvironment‐Protected Exosome‐Hydrogel for Facilitating Endometrial Regeneration, Fertility Restoration, and Live Birth of Offspring发表在《Small》上。

【图文解析】

在这项研究中，通过 Ag-S配位配伍通过将4-臂SH-PEG与Ag +交联而使ADSCs-exo负载的可注射水凝胶具有抗感染和微环境保护特性，可用于子宫内膜的薄再生和生育能力的恢复。所得的水凝胶是可注射的，并且具有与促进子宫内膜再生一致的抗菌和自我修复特性。ADSC衍生的外泌体包含与血管生成和受损的组织再生相关的关键因素，先前的研究表明它们可以抑制细胞凋亡并增强体内再生。如预期的那样，通过Ag-S配位生成的动态PEG水凝胶具有出色的可注射，自修复，可降解和抗菌特性。还可以通过微创注射入子宫内腔，从而促进组织的加速愈合。这种水凝胶的自愈特性使其即使在有节律的子宫内膜收缩和脱落的情况下也能在原位保持稳定的结构。假设这种外泌体 -水凝胶将能够促进新血管形成的子宫内膜再生和生育力恢复，同时在临床环境中减少局部组织纤维化，从而提高成功妊娠结果的比率并实现后代的活产（图1）。

图1 用于子宫内膜再生的 ADSC-exo水凝胶的开发示意图。水凝胶是通过四臂PEG-SH的Ag-S配位和ADSC外泌体的负载制备的。将由此产生的ADSCs-exo水凝胶注入子宫腔，在其中介导ADSC-exosome和Ag + 的持续释放，以促进子宫内膜的再生，增强子宫内膜的接受性，促进新血管形成，并发挥抗感染和抗纤维化的作用。

2.1 ADSC衍生的外泌体特性和活性的表征

首先从腹股沟脂肪组织样本中分离 ADSC。分离的细胞迅速扩增并表现出纺锤形，成纤维细胞样的生长模式（图2A）。免疫荧光染色显示，这些细胞中有90％以上对ECM标志物纤连蛋白和层粘连蛋白以及SOX2多能性标志物呈阳性。这些ADSC的流式细胞仪分析显示，它们对干细胞标记CD90（99.7％±4.3％），CD105（95.8％±4.7％）和CD44（98％±5.3％）呈阳性（图2B）。CD11b，CD31，CD34，CD83，CD133和MHC-II均为阴性（数据未显示）。然后使用差异离心法分离衍生自这些ADSC的外泌体，随后通过SEM，Western印迹，流式细胞仪和TRPS分析对这些外泌体进行表征。TRPS测量显示这些ADSC来源的外泌体大小为50–100 nm（图2C），而SEM则显示它们呈杯状或圆形外观，大小为50–100 nm（图2D），与TRP结果。流式细胞仪证实这些外泌体是高纯度的，并且对外泌体表面标记CD63和CD9呈阳性（图2E），并且Western印迹法同样显示出高水平的外泌体CD9和CD63表达（图2F）。这些数据一起表明已经成功制备了ADSC衍生的外来体。还建立了外泌体释放曲线（图2G，H），并证明这些生物活性外泌体有效地封装在PEG水凝胶中，该凝胶促进了14天以上ADSC外泌体的持续释放，在此期间> 95％的这些外泌体被释放。

图2 ADSC和ADSC衍生的外来体表征。 A）对ADSC进行免疫荧光染色，发现ECM标记纤连蛋白和层粘连蛋白以及多能性标记Sox2（比例尺：50µm）的阳性率均> 90％。B）通过流式细胞仪分析ADSC，发现它们对CD90，CD105和CD44呈阳性，对CD11b，CD31，CD34，CD83，CD133和MHC-II呈阴性。相应的同型对照抗体也产生了阴性染色结果。C）ADSC-exo粒度值。D）ADSC-外泌体的SEM图像（比例尺：200 nm）。E）通过流式细胞仪评估对CD63和CD9的ADSC-exo阳性。F）通过Western印迹评估CD63和CD9的ADSC-exo阳性。G）在14天的时间内从PEG-Ag水凝胶中累积释放ADSC-exo。H）PEG-Ag水凝胶的每日ADSC-exo释放曲线。

2.2 ADSCs-满载Exo的PEG水凝胶的特性

在本研究中开发的 PEG-Ag水凝胶如图3A所示。简而言之，四臂PEG通过Ag-S配位与Ag +交联，生成可注射的PEG-Ag，可以将其与ADSC-外来体一起装载。制备的PEG-硫醇溶液表现出优异的流动性（图3B），因此，假设这些水凝胶在注射后能够自我修复。通过SEM对水凝胶表面进行了评估（图3C），发现已掺入和未掺入ADSC-外泌体的水凝胶之间无显着差异，表明ADSC-外泌体与PEG水凝胶成功结合。作者还证实了这些制备的水凝胶适合注射，并且能够在去离子水（DI）溶液中保持其形状（图3D）。在PBS溶液中，外泌体水凝胶可以在 4天之内保持一定的质量，因为从第四天开始，外泌体水凝胶的降解速度加快了，并且只有10％的质量在10天后仍未充分降解（图3E）。这种降解行为为体内ADSCs外泌体提供了稳定的结构，以促进受损子宫内膜的组织再生并调节局部微环境。然后，评估了制备的ADSC-exo水凝胶耐受外部应变的能力。损耗模量（G”）能够承受约60％的应变增加，而弹性模量（G'）则持续下降（图3F，G）。流变仪还用于评估可回收性，表明在施加高剪切速率之前，ADSC-exo水凝胶能够保持胶体状态，同时保持≈7.5×105 Pa的粘度。在高剪切速率下，该水凝胶的结构被破坏，粘度降至≈0.7×105 Pas。然而，在高剪切速率去除的几秒钟内，水凝胶恢复到类似于施加剪切力之前的状态（图3H）。经过两步的应变循环，这些PEG水凝胶的G'明显降低，而制得的ADSC-exo水凝胶的G'仅显示微不足道的变化（图3I）。

图3 ADSCs水凝胶表征。A）自愈和注射机制。 B）四臂PEG-硫醇，AgNO3和脂肪干细胞衍生的外泌体的混合物。C）水凝胶和ADSCs-水凝胶制剂的SEM图像。D）注入蒸馏水后的水凝胶图像。E）水凝胶和ADSCs-水凝胶的体外降解曲线。F）PEG-Ag水凝胶的储能模量的应变扫描测量值（G'和G”分别对应于弹性模量和损耗模量），单位为kPa。G）ADSCs-exo @水凝胶的储能模量的应变扫描测量。H）测得的粘度参数与时间之间的关系，以秒为单位。测得的应变剪切率在100 s的0.05％和50 s的500％之间。I）在两次1000％阶跃应变的循环之后，各种水凝胶的G’回收率。J）Ag离子从水凝胶和ADSCs-水凝胶中的释放行为。K）ADSCs-exo水凝胶的体外细胞毒性和第1、3和5天的活细胞定量分析。

2.3 ADSC-Exo和HUVEC生物相容性的体外评估

血管生成是内皮细胞增殖，迁移和管形成产生可支持组织修复的新血管的过程。在此，这种基于3天的治疗后免疫荧光Ki67染色评估了制备的ADSC-exo水凝胶在体外影响HUVEC增殖的能力。该分析表明，ADSC-exo水凝胶和ADSC-exo治疗组中的大多数细胞均显示Ki67阳性，而在其他治疗组中检测到的Ki67阳性细胞却很少（图4A），而ADSC-中的Ki67阳性率最高。exo水凝胶组相对于其他治疗组（图4B）。

图4游离ADSC外泌体或AgNO3+ ADSC外泌体对HUVEC增殖，迁移和管形成的影响。A）使用免疫荧光染色检测Ki67，作为指示的治疗组中HUVEC增殖的量度（比例尺：50μm）。B）量化指定组的Ki67阳性细胞数量。C）对所示治疗组中的HUVEC进行Transwell迁移分析（比例尺：200μm）。D）定量Transwell分析中迁移的HUVEC的数量，显示在ADSC-exo或AgNO 3 +ADSC-exo处理后迁移增强。E）将指定治疗组中的HUVEC细胞用于体外管形成测定。F）量化每个视野中的试管数量，揭示了ADSC-exo或AgNO 3 +ADSC-exo处理后HUVEC试管形成的改善。

2.7制备水凝胶促进体内子宫内膜再生的能力评估

在 mRNA水平上，ADSC-exo治疗与VEGF，LIF，avβ3和IGF-1的表达显着增加相关（图8A），而在ADSC-exo水凝胶治疗组中这些标志物的表达则进一步增加。在这些相同的治疗组中，还观察到了LIF，VEGF和IGF-1蛋白水平的相同趋势（图8B，C）。为了评估ADSC-exo水凝胶治疗对子宫内膜再生的影响，作者通过在妊娠第18天和第20天收集胚胎来评估各组的植入率（图9）。假手术组的妊娠率和着床率最高，而ADSC-exo和ADSC-exo水凝胶组的妊娠率和着床率均没有明显提高（图9A）。这表明该 ADSC-exo水凝胶能够促进功能性子宫内膜再生，有利于恢复生育能力。ADSC-exo水凝胶治疗组的胚胎和新生儿均表现出正常发育，表明该治疗组的子宫内膜形态和功能均正常（图9B）。

图8 ADSCs-exo和水凝胶移植对子宫内膜容受性和血管新生标志物表达的影响。 A）使用qRT-PCR方法评估子宫内膜接受性标志物（HOXA-1，LIF，ER，PR，整联蛋白β3，IGF-1）和血管生成（VEGF，bFGF）的表达，其中β-肌动蛋白为标准化控件。B）使用蛋白质印迹法评估每个治疗组中的LIF，VEGF和IGF-1蛋白表达。C）不同治疗组中LIF，VEGF和IGF-1水平的蛋白质印迹数据。

图9 外泌体水凝胶治疗对生育力恢复的影响。胚胎植入效率被评估为子宫内膜再生的指标，其中植入，正常早期胃化和活后代出生被量化。A）手术后8周，不同治疗组（假手术，模型，水凝胶，ADSC-exo，ADSC-exo水凝胶）的妊娠。B）ADSC-exo水凝胶组的SD大鼠胚胎和新生儿表现出与假手术对照组中观察到的正常发育一致的正常发育。

参考文献： doi.org/10.1002/smll.202007235