突变率提高23万倍、可一天完成变异筛选，新型定向进化系统或可用于哺乳动物细胞 | 专访易啸|变异|哺乳动物|易啸|突变率|细胞

在非哺乳动物细胞中进化得到的蛋白质，常常会因错误的折叠修饰、分子间相互作用、错误的细胞定位等因素，无法在复杂的哺乳动物细胞中正常工作。因此，开发能够应用于哺乳动物细胞中的定向进化技术是一大趋势。

“我们开发的 TADR 系统应用范围更广，在大肠杆菌、酵母甚至哺乳动物细胞中都有应用潜力。” 易啸说。

易啸是中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所（以下简称为 “合成所”）研究员，博士师从明尼苏达大学分子进化学家 Antony Dean 教授学习种群遗传学和生态学，并与其导师提出了生物多样性的新理论，后期从理论转向实验研究。他在博士后期间与工程生物学结缘。

今年 7 月，易啸作为第一作者和并列通讯作者在 Science Advances 上发表最新研究成果。该团队利用合成生物学的方法开发了一个“智能” 细菌系统—— 靶向性人工 DNA 复制体（TADR），该系统能够在活细胞内将大量突变快速靶向到指定的任意一段 DNA 序列上，而不会影响基因组的其他部分。

“TADR 系统将突变率提高了 23 万倍，一天即可完成变异筛选，快速进化基因。我们正在探索潜在应用方向，比如说用该系统进化指定的大分子或者抗体。” 易啸说。

（来源：Science Advances）

TADR 系统是易啸在博士后期间的一个合成生物学项目。在博士后研究阶段，易啸花费 5 年时间独立设计开发出了 TADR 系统，并获得了相关技术的美国专利。现在他已经在合成所材料合成生物学中心成立了合成进化实验室，该实验室的一大重点就是围绕 TADR 系统展开基础研究和探索应用场景，解决科学和生产问题。

易啸坦言，现阶段，TADR 系统是其在研究生涯过程中最有成就感的一项研究。

将突变率提高 23 万倍，一天即可完成变异筛选

细胞外突变法是目前最为成熟且直观的一种定向进化方法，包括易错 PCR（error-prone PCR）、易突变菌株（mutator strains of bacteria）以及可产生非随机突变的定点突变（site-directed mutagenesis）等。

然而，这种方法往往需要密集的人工操作，多数情况下只能在有限的突变库上进行一轮进化。如果想要得到更有优势的蛋白质，或者完成更复杂的定向进化目标，就需要更大体量的突变库，以及进行多轮迭代进化。

为了突破这些瓶颈，加快进化速度，更快获得更复杂的进化目标，研究人员开始尝试开发细胞内突变方式。

易啸团队开发的 TADR 系统就是一种细胞内突变方法，整个进化过程在活细胞里面完成。TADR 系统系统也叫最简 DNA 复制体，是由三个蛋白质组成的蛋白复合体，分别为噬菌体蛋白 CisA、细菌 Rep 解旋酶、T5 噬菌体 DNA 聚合酶的出错性突变子。

该系统能够在短时间内把大量突变靶向指定的 DNA 上面，同时保留基因组其他部分的完整性。

具体来说，他找到了一种噬菌体，其在天然复制过程中有一个能够特异性识别 30 碱基对序列的蛋白，识别以后，噬菌体就从该位点开始复制 DNA。所以他把出错率高的 DNA 聚合酶融合到了这个噬菌体的蛋白上，利用这个噬菌体的蛋白去把出错率高的 DNA 聚合体靶向到指定突变的 DNA 上游。

（来源：Science Advances）

易错 PCR 是一种简便快速在 DNA 序列中随机制造突变的方法，通过改变传统 PCR 反应体系中的 Mg2+ 浓度、dNTP 的浓度比例、pH 值等，使碱基在一定程度上随机引入错误而创造序列多样性文库。这种方法的关键在于控制合适的突变频率，较低的突变率能够积累大部分的有益突变，而较高的错掺率则会产生中性突变或有害突变。

“与基于出错 PCR 和体外质粒构建的传统定向进化方法相比，TADR 可以避免分子连接、细胞转化等效率极低的步骤，从而实现在活细胞内快速连续进化分子和细胞表型的潜力。” 易啸说。

该团队进一步对 TADR 系统进行了量化，研究表示，与野生型突变速率相比，TADR 的突变速率提高了约 23 万倍，即 2.3*10^5。

易啸表示，该系统可以快速找到非常低频的有益突变，加速分子突变速率。比如说，使用传统方法可能需要一个星期，利用 TADR 只需一天即可完成变异筛选。

该系统可能会与合成所大设施的功能结合起来，相当于添加了一个分子突变的功能档。易啸透露，还需要在功能档上加一个细菌生长培养的模块。最终与大设施形成一个连续突变和大规模筛选的闭环，不断继续循环，能够非常快速在实验室里面进化出我们想要的大分子。

操作简单，应用场景更广

在细胞内连续突变领域，目前已有两大成熟系统，一是哈佛大学刘如谦团队于 2011 年开发的噬菌体辅助的连续进化方法（phage-assisted continuous evolution，PACE），另一种方法是加州大学尔湾分校教授 Chang C. Liu 开发的一种正交 DNA 聚合酶 - 复制子系统（orthogonal DNA replication，OrthoRep）。

PACE 系统在许多蛋白质进化应用中已经得到了验证，但是只有与细菌中基因转录相关时，PACE 系统才可以进化给定的目标蛋白。也就是说，给定的目标蛋白只能在大肠杆菌细胞质进化，折叠不良或者需要翻译后修饰都会妨碍利用 PACE 系统的进化。

与 PACE 系统类似，OrthoRep 系统对生物物种也有选择性，需要与酵母增殖活动相关，只能在酵母（真核细胞）中才能进行功能性表达。

“这两大系统在概念上实现了一定的创新，可以相应解决一些问题，但是存在一定的局限性，很多分子进化问题无法利用这两个系统解决，应用场景受限。” 易啸说。

图丨 PACE 系统（来源：Nature）

正是看到了这两大系统各自存在的盲区，易啸在博士后研究期间专注于开发一种可以在哺乳动物甚至更多生物物种中使用的系统。

在论文中，易啸利用合成生物学思路构建了 TADR 系统，该系统结构简单，可以实现模块化，比如说关闭 TADR 系统后，细胞和目标质粒仍然能够继续增殖。模块化能力也提供了 TADR 扩展到其他细胞类型甚至无细胞系统中的可能性。

易啸介绍，TADR 系统比前两个系统操作更加简单，更容易上手。从原理上讲，它可能在酵母、甚至哺乳动物细胞中快速进化，应用场景很广，几乎没有限制。

“我的实验室接下来将会开展相关研究，把该系统应用到不同的物种中，进一步扩大应用范围。” 易啸继续补充。

现阶段，易啸将该系统的应用方向瞄准了材料领域，现已与合成所材料合成生物学中心研究员钟超进行了深入交流。

“材料研究涉及到物理、化学原理和实验，而这些也恰恰是做进化、筛选的基础。实现物理、化学、生物的交叉融合，这是一个比较新的应用方向，我们可以在实验室快速进化和筛选活体材料所需的性质，加强现有材料性质，甚至进化出一些原本不存在的材料性质。”

“合成所的学术氛围就像年轻人共同创业”

今年是易啸回到合成所成立实验室开展研究工作的第一个年头，他于 2008 年本科毕业后赴美攻读博士学位，加入合成所之前，他已经在海外求学 12 载。

对于易啸来说，TADR 系统的设计和开发工作也并非一帆风顺。

“在美国进行博士后期间，我用了整整 5 年才开发出 TADR 系统。其中前 3 年半全部都在试错，而且失败得一塌糊涂，TADR 系统最开始的设计和现在的设计几乎完全不同，所以开发出的系统一直存在缺点。直到最后一年半时间，TADR 才开始达到预期，可想而知，我在前 3 年半时间面临的一些困难和内心的煎熬。” 易啸回忆道。

在他看来，科研工作中总是会经历或大或小的挫折，我认为在这期间最重要的是要对科研工作保持坚持执着的心态。

“作为一线科研人员，我们需要做一些科学探索工作，不断探索人类未知的前沿领域，发现新概念，甚至颠覆一些陈旧的认知。同时还需要有一定的社会关怀，制定与社会利益相关的远大目标。” 易啸说。

这一点也与中国科学院深圳先进技术研究院（以下简称深圳先进院）“顶天立地” 的理念也不谋而合。即 “天” 是学问，“地” 是产业，“顶天立地” 理念贯穿于深圳先进院十个所的发展始终，作为其中较为年轻且发展迅猛的研究所，合成所亦是如此。换言之，造物致知就是顶天，造物致用就是立地。

“合成所的学术氛围很活跃，老师们也都很年轻，加入合成所就好像一帮年轻人共同去创业，大家一起去干一番自己的事业。” 易啸坦言。

关于未来的发展规划，易啸将重点围绕两个研究方向：第一个方向是偏向于基础科学研究，在实验室进化细胞，将统一进化过程重复 N 次，探索生命体的可能空间；第二个方向是基于 TADR 的工程应用，在三年内使该技术更成熟，未来可以让蛋白质工程、大分子开发人员等更多科研人员都可以用上 TADR 系统。

同时，观鸟是易啸的爱好之一，办公桌上的望远镜、单反相机都是他观鸟的必备神器。最近易啸老师会在深圳先进院旁边的大沙河公园中用无人机拍水鸟，“以鹭这种类型的鸟为例，在大沙河上基本都能够找到，比如苍鹭、大白鹭、小白鹭，夜鹭……”

易啸作品丨大白鹭，摄于大沙河

参考资料：

https://advances.sciencemag.org/content/7/29/eabg8712/tab-figures-data

采访丨刘瑾、汪琳

录音稿整理丨宋冉陈茜

编辑丨刘瑾