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液体活检CTC技术梳理

癌症是严重危害人类健康的最恶性疾病之一，且全球癌症发病率和死亡率正在迅速上升。复发或转移是导致恶性肿瘤患者预后不良和死亡的主要原因。传统的活组织检查受到采样偏倚及可采样组织区域的限制，且通常侵入性较大。液体活检与传统的组织活检“金标准”相比，是一种创新且明显侵入性更小的技术，且几乎可以重复取样，因而更安全和时效性更高，已受到研究人员们越来越多的关注。

液态活检的来源包括CTC（循环肿瘤细胞）、ctDNA（循环肿瘤DNA）、microRNA（循环microRNA）、Exosome（外泌体）等四种。其中CTC（循环肿瘤细胞）研究被认为是液体活检领域的新起点。

CTC（循环肿瘤细胞）是由肿瘤原发灶或转移灶脱落释放到体液中的肿瘤细胞。CTCs携带肿瘤和转移组织的遗传和表型的生物学信息，可以增加对肿瘤和转移扩散过程的了解，并且可以对疾病进展和治疗反应进行实时监测。

01 循环肿瘤细胞的特性

1. 稀有性：每10mL血液中含有 1 亿 个白细胞和 500 亿个左右红细胞，而CTC的数目可能仅有几个到几十个，难以富集并分离。

2. 非典型性的细胞形态：一般比血液细胞或正常组织细胞体积大；细胞核大，细胞核质比高；形状不规则，不易发生变形。

3. 异质性：细胞表面抗原标志物表达差异；携带不同的分子信息；转移潜力差异。患者血液中存在的可检测的CTC比例随癌症类型的可能不同，即使是同一病人来源的CTCs 之间也存在细胞标志物和表达量的不同。

4. 不同形态和类别：在循环过程中发生根据是否发生上皮间质转化(EMT) 及表面标记物的变化，CTC被分为上皮细胞表型， 间质细胞表型和混合表型等不同类型。CTC也既可以是单个细胞，血小板包裹的CTC,也可以是成团的CTCs(CTM)。

注：图为融资金额与领域之间的关系

CTC分选、富集效果的优劣将会直接影响其后续的检测(计数、免疫荧光、基因扩增、基因测序等)效果，因此高纯度、高灵敏性(不丢失CTC)、快速、高细胞活性的CTC分选富集是CTC临床应用的重点和难点。

02 CTC的分离

目前已经有40多种方法用于分离CTCs，主要包括基于CTC生物学特性和基于其物理特性的分离方法两大类，即免疫亲和富集法和物理特性富集法。

1. 免疫亲和法：根据细胞表面表达的特异性的蛋白将CTC筛选出来；

2. 物理特性富集：根据CTC的大小和密度等特性将这些细胞筛选出来。

图：CTC分离方法

物理分离富集方法

物理分离富集方法物理方法，是基于CTCs与血细胞在大小、密度、可变形性、电性质等方面的差异所采用的分离富集方法，此方法不依赖于上皮细胞粘附分子（EpCAM）或其他细胞表面上的特异性抗原的表达。

免疫分离富集方法

免疫分离富集方法，是通过特异性抗体靶向表面抗原来将CTCs与其他血细胞分离。免疫分离富集方法分为阳性富集和阴性富集。

阳性富集方法：通过肿瘤特异性抗体靶向肿瘤细胞的特异性抗原，CTC分为上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮间质细胞混合表型，因此用于CTC阳性富集的特异性抗体分为阳性富集的特异性抗体分为识别上皮标志物、识别间质标志物和识别上皮间质标志物三种。其中，上皮细胞粘附分子（EpCAM）是最常用的上皮表型CTC富集标志物，它在正常上皮细胞和上皮肿瘤中表达，但在间质白细胞上不存在，因此经常用于区分癌细胞和正常血细胞。此外，由于细胞骨架蛋白对于上皮细胞具有特异性，细胞角蛋白家族成员（CK8，CK18和CK19）也已成为检测具有上皮表型癌症患者经成为检测具有上皮表型癌症患者CTC的金标准标记物。

阴性富集方法：通过靶向白细胞表面抗原标志物，如CD45，CD14等，从而去除白细胞后捕获CTCs。

图：CTC分离富集方法

免疫分离富集方法有免疫磁珠法、微流体芯片免疫捕获法、微流体芯片+纳米材料法。

免疫磁珠法

使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。其中的典型代表是CellsearchTM系统，CTC芯片（CTCs-chip）和MACS®CellSeparation磁性细胞分选系统。

原理：采用抗EpCAM结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTC。

优点：捕获的CTC纯度较高；能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTC。

缺点：无法捕获到间质型CTC（EpCAM阴性）。通常步骤较多( 如离心、洗涤和孵育) ，导致大部分 CTCs 的损失和/或破坏，且只能分离固定的，无活力的细胞。

CellSearch

CellSearch系统是基于免疫磁珠法阳性富集法的代表，也是目前为止的唯一获得食品和药物管理局(FDA)批准上市的具有预后价值的CTCs检测技术。CellSearch使用原理是由包覆上皮细胞特异性EpCAM抗体的免疫磁珠捕获表达EpCAM细胞，然后用细胞角蛋白和CD45荧光抗体以及核染料荧光标记细胞对CTCs进行筛选分离，捕获的样品在四色半自动荧光显微镜CellSpotterAnalyzer上进行分析。

但该方法受上皮标志物表达影响。到目前为止，仍未有公认和普适性的肿瘤表面抗原标志物，原因有以下几方面：

1. 并非所有肿瘤细胞均表达上皮标志物，例如黑色素瘤并不表达上皮标志物。

2. 肿瘤细胞入血时会发生上皮－间质转化（EMT），下调上皮标志物表达量，导致磁珠对CTC的吸附能力下降，影响检出率。

3. 在正常情况下，有极少量的正常上皮细胞脱落入血，或者肿瘤患者在进行手术或其他创伤性治疗后，上皮细胞可进入血液，导致假阳性的出现。

侵袭性肿瘤中通常会发生EMT过程，导致上皮标记物的下调。因此，对上皮细胞的阳性富集可能会漏检转移疾病方面中最重要的CTCs，且与设备表面结合的CTCs难以释放。为解决该情况，研究人员设计了MagSweeper系统，该装置使用覆盖有可移除的超薄(25μm)非粘附塑料套管的圆底钕磁棒捕获用磁性颗粒预标记的稀释血液样品中的CTCs，可允许多次捕获和释放循环，实现高纯度分离和高捕获效率。

微流体芯片免疫捕获法

微流控芯片技术目前已经历了三代的发展过程：第一代芯片为以CTC Chip 为代表，第二代芯片以 HB Chip 为代表，第三代芯片以 CTC iChip 为代表。

CTC 芯片由数万个带有抗 EpCAM 抗体微柱阵列组成，当血样流经 微柱时，抗 EpCAM 与血液中 CTCs 结合从而捕获 CTCs。通过优化微柱几何排列和液体流速及剪切力，细胞与微柱的相互作用增强，提高细胞捕获效 率

原理：采用带有抗EpCAM抗体的微柱捕获EpCAM阳性CTCs

优点：可以从全血中分离活的 CTCs；无需预稀释、预标记、预固定等处理步骤

缺点：微柱几何结构复杂，生产制造成本高

CTC-Chip是第一个能够成功处理全血捕获 CTCs 的微流体装置，CTC 芯片的在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌 等转移性癌症患者外周血使用 CTC-Chip 装置 CTCs 捕获的纯度可以达到 50%。但基于微柱结构的芯片由于复杂的微柱设计很难在大规模基础上进行高通量生产。此外，目前用于CTC检测和表征的技术严重依赖于免疫细胞化学和需要高分辨率成像的其他技术，这在非透明三维微柱阵列的存在下是困难的。

图：CTC-chip工作原理

第二代芯片是以HB-Chip为代表，包括GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的ModularSinusoidalMicrosystem微流表面富集，此类芯片使用抗体包被捕获CTC，能更高效地捕获CTC，捕获效率约为90%，更适合大规模生产。但是，这类芯片所捕获的CTC被固定在抗体包被的装置表面，难以进一步分离。虽然胰蛋白酶能将CTC从装置表面消化并释放，但是经胰蛋白酶消化释放的CTC可能失去很多有意义的表面受体。

第三代芯片以CTC-iChip为代表，包括Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的LiquidBiopsy和Fluxion公司的Isoflux微流免疫磁珠富集，这类芯片将免疫磁珠和微流控富集技术相结合，捕获效率与第二代芯片相当，为 90% 左右。

此外，还有CTCs芯片以及用纳米毛刷上的抗体捕获等新型CTCs分离技术。

CTC分离富集技术的局限

当前CTCs用于液体活检的技术仍处于发展阶段，仍有许多制约因素限制其临床应用，其中最为关键的一个是：

上皮间质转化后的CTC因为不表达EpCAM所以不能被以EpCAM为基础的方法捕获，存在漏检。

上皮-间质细胞转化（EMT）表现为：细胞连接与极性的丧失，及获得间质细胞的表型特征。研究表明，EMT在肿瘤中相当普遍，并且在肿瘤转移过程中起着重要作用，使肿瘤细胞变得更具侵略性、耐药性和肿瘤转移性。EMT过程通常伴随间充质标记物（例如Vimentin，N-Cadherin和Twist）的过表达，同时降低上皮标志物（例如EpCAM，CK和E-Cadherin）的表达，形成上皮表型、间质表型和上皮间质混合表型三种类型CTC。

图：CTC上皮-间质转化

循环肿瘤细胞CTC是异种细胞的集合，包含上皮型、间质型和上皮间质混合型CTC。由于CTCs异质性的存在，上述CTCs检测方法尚有许多不足：基于免疫亲和性的CTCs分离方法，由于CTCs在血液中经历上皮间质转化(EMT)，其抗原性丢失，从而可能导致假阴性的结果，且CTCs结合至装置表面增加了CTCs无损释放的难度；基于生物物理原理的CTCs分离技术，因CTCs与白细胞等血细胞的生物物理特性存在一定交叉，导致获得的CTCs纯度不高。因此迫切需要开发一种更灵敏、更具特色、更简便高效的检测系统。

Satelli等成功开发出针对细胞表面波形蛋白（CSV）的抗体，特异性捕获间质表型CTC。CSV抗体捕获间质型CTC及其临床应用，已在乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌和胰腺癌中得到验证。EpCAM和CSV可以分别用作分离上皮和间质亚型CTC的靶标。乳腺癌和胰腺癌研究表明，与EpCAM相比，使用CSV捕获CTC更有效。早期和转移性乳腺癌患者之间的比较研究中，分别在73%和100%的患者中发现了间质型CTC。研究显示间质型CTC具有更多的临床意义，通常与肿瘤转移、疾病进展和预后较差有关。

【注：波形蛋白（Vimentin）是一种57kDa的中间丝蛋白，是间充质细胞的主要细胞骨架成分。由于癌细胞的EMT诱导波形蛋白的过度表达和波形蛋白向细胞表面的转运，CSV可以特异性捕获间质表型CTC】

此外，富集CTCs的过程中很难保持其完整性及高细胞活性，如流式细胞技术会破坏细胞团，胰酶消化会损失细胞表面受体、尚未形成标准化的单个和成团的细胞富集技术、目前用于分离分析CTCs中DNA的技术不够灵敏等都问题都是制约CTCs应用于临床的因素。如何解决这些制约因素，为临床应用提供更多有价值信息，更精准地预测肿瘤复发转移和疾病进展等，将是未来研究的重点方向。

03 CTC的检测与分析

目前的检测主要以CTC的计数为预后 。除 CTC 数量外，CTC 簇、CTC 染色体改变、基因 突变和基因表达、细胞分型等也被证实与肿瘤疗效和预后相关。根据 CTC 染色体和基因突变以及表达情况对 CTC 进行分型， 确定具有特殊临床意义（如耐药、转移、复发等）的 CTC 亚型，能够为后续 CTC 单细胞研究提供更明确 的指导意义。

图：CTC检测分析的应用

CTC检测主要包括从蛋白、染色体、DNA和RNA水平实现对肿瘤细胞的定性工作。

在蛋白水平，利用免疫荧光标记，如选用CD45-/CK+/DAPI+作为肿瘤细胞定性的标志物，EPISPOT方法可以区分凋亡和有活性的CTC。细胞骨架蛋白对上皮细胞具有特异性，因此细胞角蛋白家族成员（CK8、CK18和CK19）也成为检测上皮表型CTC的标志物。鉴于上皮标志物的局限性，针对干细胞标志物（CD133），间充质标志物（波形蛋白）和肿瘤组织特异性抗原，例如前列腺特异性抗原（PSA）、乳腺特异性抗原乳珠蛋白等也被用于CTC检测。在染色体水平，荧光原位杂交技术能检测特定染色体的扩增情况和靶基因的扩增情况；在DNA水平，基因测序和ARMS可以检测到丰度低至0.1%~1.0%的突变基因；在RNA水平，基因表达图谱和qPCR技术可检测CTC基因表达水平。

03 CTC的临床应用前景

CTCs在早期诊断、评估疗效和判断预后等方面扮演重要角色，为肿瘤的诊断和治疗开创了新的视野。因此，捕获血液中的CTCs进行检测和分析具有十分重要的临床意义。

CTCs多用于跟踪监测不同的突变型，特定的CTCs亚群还能决定肿瘤转移的器官倾向性。同时，CTCs还能用于功能性研究，包括CTCs的产生、存活、与血液组分的相互作用以及CTCs进入血流后产生的远处损伤。因此，CTCs可为转移性肿瘤细胞的溯源提供有价值的信息。

图：CTC检测的临床应用

在活检易引起高转移性风险的肿瘤患者中，CTCs检测也有其优势，可用于判断肿瘤对靶向治疗的反应，如监测肿瘤表面的PD-L1蛋白。另外，通过对CTCs进行基因分析，尤其是转录组学分析，对于转移过程的研究非常重要。如采用RNA测序可检测胰腺癌鼠模型中非经典Wnt通路中的肿瘤转移关键信号。在CTCs的DNA甲基化分析中，目前已经发现CTCs具备一些与肿瘤上皮间质转化（EMT）相似的甲基化改变。

目前CTC的应用主要在以下几个方面：

1. 在常规手段无法对早期肿瘤进行判断时进行辅助诊断。

2. 在疗效评估方面，癌症患者进行化疗、靶向治疗后进行CTC检测，若CTC数量减少，提示治疗方式可能有效。相比于现阶段的检查手段，CTC检测技术操作更方便，应用更简单，可以更及时地提示医生该患者是否适合化疗或靶向治疗。

3. 在术后监测方面，主要是由于活检无法高频次检测，而目前CTC检测在术后监测中应用会更方便，检测频次会更高。

CTC在肿瘤疗效和预后评估中的作用

CTC已被认为是一个可靠的预后指标，无论在手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗过程中都显示出了良好的疗效和预后评估价值。在可手术切除的非小细胞肺癌患者中发现，术前外周血和静脉血CTC计数是TFS（time to failure of strategy，治疗失败时间）和OS（overall survival，总生存）的独立危险因素，而术中首先离断流出静脉可减少肿瘤细胞的播散，改善患者的生存结局。也有研究证实术前肺静脉CTC阳性预示更高的疾病复发风险。一项纳入200例胰腺癌患者的前瞻性CLUSTER研究提示，无论是否接受新辅助化疗，术前CTC计数与胰腺癌术后复发显著相关。因此，术前CTC检测不仅可预测无疾病生存期，也为手术方式和术后治疗方案的选择提供依据。

CTC不仅能够预测放疗疗效，还可能为优化放疗人群和放射剂量提供依据。CTC与免疫细胞活性、血小板等肿瘤微环境检测相结合，能共同分析肿瘤复发转移风险，有利于更全面评估预后。

CTC对肿瘤早期诊断的作用

虽然CTC最早被认为是肿瘤转移的早期分子标志，但是随着CTC在早期肿瘤患者外周血中的发现，越来越多的研究提示CTC不仅对早期肿瘤诊断具有重要的作用，而且与肿瘤分级和TNM分期也具有相关性。多种研究及实证表明，CTC的检测对鼻咽癌、非小细胞肺癌、肝癌在内的多种疾病的早期诊断都有一定临床意义，此外，CTC与其他肿瘤标志物联合也有助于提高肿瘤早期诊断的准确性。目前随着高通量测序技术和单细胞测序技术的出现，CTC全外显子测序和单细胞测序将有助于更进一步揭示肿瘤异质性和肿瘤演进过程。

图：CTC的临床应用总结

来源：《循环肿瘤细胞检测技术进展及其临床应用》

结

语

目前，CTC已被证实为转移性乳腺癌和其他实体肿瘤（如前列腺癌、结直肠癌和肺癌）的预后标志物，在预后评估方面比传统影像学方法具有更高的准确性，利用循环肿瘤细胞可监测并早期发现患者的微小残留病变。另一方面，循环肿瘤细胞的分子特征对于指导药物靶向治疗的选择具有重要意义，它能提供不同分子靶点的动态变化。研究证实，循环肿瘤细胞的定性和定量分析已成功地应用于肿瘤的进展、预后、诊断和反应的评估及个性化治疗。

CTCs检测的未来方向是下游分析，CTCs的基因组谱分析可能对癌症的诊断和治疗更有帮助。CTCs计数结合分子谱分析，可以检测CTCs亚群、癌症亚型和导致癌症发生发展和耐药性的基因突变。使用精确和高通量的下一代测序(NGS)技术，可以对单个CTC进行基因分型，用于肿瘤的突变分析。下游分子分析要求更可靠的分离和富集技术，从而捕获高纯度和可行的CTCs用于下游分析。

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