JMC：高活性和可口服的雄激素受体PROTAC降解剂的发现

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导读

近日，密歇根大学安娜堡分校的王少萌教授基于化合物9和10，对其进行结构修饰发现了口服生物利用度优异的PROTAC AR降解剂，可作为潜在的抗癌药物。相关成果发表在J. Med. Chem.上（DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00432）。

雄激素受体（A ndrogen receptor, AR ）属于类固醇受体超家族，是一种配体依赖型反式转录调节蛋白，广泛分布于雄性和雌性的肝脏、心脏、神经系统和生殖系统中，其能够通过与内源性配体激素结合来介导下游信号通路的转导和基因的表达，对于雄性和雌性的生长发育起到了关键作用。越来越多的研究表明， AR 是前列腺癌发生和发展的关键驱动因子，尤其是转移性去势抵抗性前列腺癌（ Metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC ）。至今为止，已有多款 AR 拮抗剂被批准用于治疗 mCRPC ，比如恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和达洛鲁胺等，但大多数的患者最终都出现耐药性。因此，研发具有抗耐药性的 AR 拮抗剂具有重要意义，不仅可作为治疗前列腺癌的潜在药物，还能够改善由耐药所带来的副作用。基于此，药物化学家发现了选择性雄激素受体降解剂（ selective androgen receptor degraders, SARDs ），通过靶向AR的配体结合结构域而干扰AR - 共调节因子的相互作用，从而诱导蛋白依赖性降解。其中研究最多的莫过于靶向A R的PROTACs， 并陆续报道了一些基于不同 E3泛素连接酶 的PROTAC AR降解剂（ Figure 1 ），但仍缺乏高活性、副作用小和口服活性优异的 PROTAC AR降解剂。 因此，研发高活性和可口服的 PROTAC AR 降解剂是目前的研究新方向。 下载化学加APP，阅读更有效率。

近日， 密歇根大学安娜堡分校的王少萌教授基于化合物9和1 0 ，对其进行结构修饰发现了口服生物利用度优异的 PROTAC AR 降解剂，可作为潜在的抗癌药物 。相关成果发表在 J. Med. Chem. 上（DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00432）。

图片来源：J. Med. Chem.

研究表明，PROTAC的 Linker 长度对于诱导靶蛋白降解具有至关重要的作用。因此，作者首先基于 E3连接酶Cereblon 和化合物 9 对 Linker 的长度进行了筛选（ Figure 1 & Table 1 ）。引入 -NH(CH2)3NH- 得到化合物 11 ，其DC 50 可达到 1.0 nM，但最大降解率（Dmax ）仅为8 5% ，远低于ARV -110 。增加一个亚甲基得到化合物 12 ，其DC 50 为 1.0 nM，最大降解率略有增加（89% ）。继续增加亚甲基个数得到化合物 13-15 ，发现DC 50 和D max 均显著增加，尤其是化合物 13 ，其DC 50 甚至达到了0 .2 nM。基于化合物 15 ，延长碳链得到化合物 16-17 ，降解活性开始下降（ 1.5-3.2 nM），而当亚甲基增加至10 或1 1 时，化合物几乎丧失降解活性且最大降解率仅为2 5%-42% 。不难看出，化合物 13 的DC 50 和D max 最为优异，可以作为进一步结构优化的基础。

图片来源：J. Med. Chem.

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基于化合物 13 的优异活性，作者对其进行了口服性质研究，但发现其小鼠口服血浆暴露量极低。于是，作者尝试利用构象限制原理对 Linker 进行修饰以提高 PROTAC AR 降解剂的理化性质和口服生物利用度（ Table 2 ）。首先，引入带正电的哌嗪环和不同亚甲基得到化合物 20 - 23 ，发现化合物 20 和 23 保持优异的降解活性（0 .8-0.9 nM），但化合物 21 和 22 的DC 50 和D max 却显著下降，且D max 均小于 90% 。为了进一步提高化合物的降解效率，作者固定哌嗪环不变，通过将氨基替换成哌啶环和氮杂环丁烷进一步限制化合物构象，并得到了化合物 24 - 28 。令人惊喜的是，化合物 24 、 26 和 27 表现出优异的DC 50 （0 .2-0.3 nM）和Dmax （ 92-97% ），其中化合物 28 的DC 50 甚至达到了0 .1 nM，但其降解效率仅为76% 。基于此，作者评估了化合物 26 的小鼠药代动力学性质。结果显示，化合物 26 表现出优异的静脉注射PK性质，具有高暴露量、低清除率和优异的分布容积，而对于口服给药，其半衰期（T 1/2 ）为 5.6 h，峰浓度（Cmax ）为 207 ng/mL，血浆药物暴露量（AUC0−t ）为 2154 h*ng/mL，口服生物利用度（F）为30%。总之， 化合物 26 表现出优异的PK性质，可以作为进一步结构优化的基础。

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接下来，作者将修饰重点置于AR拮抗剂中，希望能够获得降解活性和效率更为优异的化合物（ Table 4 ）。首先，作者考察了环大小对于化合物活性的影响。利用环戊基、环庚基和环辛基替换环己基得到化合物 29-31 ，但几乎都丧失了降解活性（ > 1000 ），且降解效率较低（2 0%-54% ）。将裸露氨基固定在环中得到了化合物 32 - 33 ，但降解活性并没有改善，且降解效率进一步降低。为了进一步理解AR拮抗剂与AR的结合特点，作者对化合物 9 与AR的结合模式进行了预测，结果表明，连接邻氯苯甲腈和环己基的氧原子对于调节化合物构象至关重要，但并未与AR产生额外的氢键相互作用。于是，作者将氧原子替换成氨基、 N -甲基、 N -乙基和 N -丙基得到了化合物 34 - 37 。结果显示，化合物 34 的DC 50 可达到 0.3 nM，但最大降解率（Dmax ）仅为 78% 。而插入甲基或乙基的化合物 35 和 36 ，降解活性和最大降解率均显著提高增加（DC 50 = 0.1 nM, Dmax = 99% ）。延长碳链得到化合物 37 ，发现其DC 50 和D max 开始出现下降情况。基于化合物 35 的优异降解活性，作者评估了其小鼠药代动力学性质。结果显示，相比于化合物 26 ，化合物 35 的PK性质显著提高，口服生物利用度（F）也达到了 44%，可以作为进一步结构优化的基础。

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紧接着，作者基于化合物 35 重新对 Linker 进行筛选（ Table 5 ）。首先，作者在化合物 35 的Linker中插入甲基得到化合物 40 ，其DC 50 和D max 均有所下降；而将哌嗪基与哌啶基位置调换得到化合物 39 ，但其降解活性和降解效率却进一步降低（DC 50 = 1.4 nM, Dmax = 93% ）。根据化合物 35 ，将哌嗪基与哌啶基位置调换得到化合物 41 ，其降解活性保持不变，但降解效率略有下降（D max = 96% ）。进一步将哌啶环替换成氮杂环丁烷且插入甲基得到化合物 42 - 45 。结果显示，化合物的降解活性和最大降解率均显著提高增加，尤其是化合物 42 ，其活性甚至达到了0 .01 nM，同时保持了优异的最大降解率（Dmax = 99% ）。

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基于上述化合物优异的降解活性，作者对其进行了初步的小鼠PK性质研究（ Table 3 ）。从表中能看出，相比于化合物 35 ，化合物 40 、 42 和 44 的清除率更高及血浆药物暴露量更低；化合物 41 则表现出与化合物 35 相当的PK性质。而化合物 43 和 45 具有更为优异的PK性质，具有良好的半衰期（ 5.5-7.5 h）和分布容积（1.8-2.1 L/kg ）以及低清除率（ 0.2-0.3 L/h/kg ），口服生物利用度（F）分别为 51%和67% 。

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为了进一步评估 Linker 的适用性，作者研究了化合物 41 的Linker -E3 连接酶部分是否适用于F DA 批准的 AR 拮抗剂（ Table 6 ）。作者将化合物 41 的AR拮抗剂替换成比卡鲁胺、恩杂鲁胺和阿帕鲁胺得到化合物 46 - 48 ，但令人失望的是，化合物几乎没有蛋白降解活性，最大降解率也仅为1 4%-32% ，说明对于不同的AR拮抗剂，L inker并不通用。

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作者进一步评估了AR降解剂和对照化合物对VCaP Cell细胞系的抑制活性（ Table 7 ）。从表中可以看出，对照化合物 ARV-110 和 enzalutamide 的细胞抑制活性分别为3 0.4 nM和393 nM。而对于AR降解剂，化合物 24 - 27 则表现出较为优异的细胞抑制活性（ 2.7-9.7 nM ）；化合物 35-36 对 VCaP Cell 细胞系的抑制作用略有增强（ 1.8-2.1 nM ），而化合物 34 和 37 的细胞抑制活性下降了1 0-40 倍。化合物 41-44 不仅具有优异的DC 50 （ 0.01-0.2 nM）和DC Max （ 96-100% ），对 VCaP Cell 细胞系同样具有优异的抑制作用（ 0.8-5.1 nM ）。而蛋白降解活性不佳的化合物 29 、 32 - 33 和 46 - 47 则几乎没有细胞抑制活性（ >1000 nM ）。

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AR 的突变是导致 AR 拮抗剂产生耐药性的主要原因，这就要求设计的 AR 降解剂不仅具有优异的细胞活性，同时能够克服耐药性。于是，作者就评估了上述活性较为优异的化合物对耐药 LNCaP 细胞系的活性（ Table 8 ）。结果显示，对照化合物 ARV-110 对 LNCaP 细胞系的蛋白降解活性和细胞抑制活性分别为 1.5 nM 和 33.1 nM。相比于 化合物 ARV-110 ，化合物 35 和 41-44 不仅具有优异的DC 50 （ 0.1-1.9 nM）和DC Max （ 95-99% ），对 LNCaP 细胞系同样保持着优异的抑制活性（ 11.4-22.3 nM ）。而化合物 45 具有优异的DC 50 （ 1.3 nM）和细胞抑制活性（21.7 nM ），但其DC Max 仅为6 4% 。

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紧接着，作者对部分化合物的药效学和组织分布进行了探究（ Figure 3 & Table 9 ）。首先，作者研究了化合物在 VCaP 移植肿瘤模型中的蛋白降解活性，结果显示，化合物 35 、 41 、 43 和 45 能够有效降解AR蛋白，且出现时间依赖性，但其中化合物 35 的降解效果要稍逊一筹。接着，作者继续考察化合物的组织分布情况。从表中看出，化合物 35 、 41 和 43 在肿瘤组织的分布明显高于血浆和前列腺的分布，而化合物 45 的分布情况恰恰相反，其在血浆的分布高于肿瘤组织的分布，这也就印证了其PK性质。

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鉴于化合物 41 和 43 （ ARD-2585 ）的优异蛋白降解活性，作者进一步考察了其在 VCaP 移植肿瘤小鼠模型中的蛋白降解活性（ Figure 4 ）。结果表明，化合物 41 在3 h和6 h的蛋白降解率分别为74% 和7 0% ，但在2 4 h的降解率下降至20% 。相比之下化合物 43 在3 h和6 h的蛋白降解率分别为78% 和 60% ，在2 4 h的降解率仍能达到78% 。基于此，作者进一步研究了 ARD-2585 的组织分布情况（ Table 10 ）。不难看出，随着时间的推移， ARD-2585 在肿瘤组织的分布显著增加 。

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作者探究了 ARD-2585 在 VCaP 和 LNCaP 细胞系中的蛋白诱导降解机理（ Figure 5 ）。结果显示，在1 00 nM剂量下，ARD-2585 能够有效降解 VCaP 和 LNCaP 细胞系中的AR蛋白，且在AR抑制剂 thalidomide 、蛋白酶体抑制剂 MG-132 和 MLN4924 的作用下， ARD-2585 诱导AR蛋白降解会被有效抑制，说明 ARD-2585 蛋白诱导降解的机理是依赖于 cereblon 、蛋白酶体和 neddylation 的复杂机理。

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作者又继续考察了 ARD-2585 的体内抗肿瘤活性（ Figure 6 ）。在 VCaP 移植肿瘤小鼠模型中， ARD-2585 能够有效抑制肿瘤生长，在3个剂量下的肿瘤抑制率分别为 54.9 、 74.3 和 65.9% ，且随着剂量的增加并未出现明显的体重下降。

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最后，作者评估了 ARD-2585 在 VCaP 细胞系和携带有不同突变的细胞系中的蛋白诱导降解活性。结果显示，在0 .1-1 nM水平下，ARD-2585 能够有效诱导 VCaP 细胞系、T 878A 突变的 LNCaP 细胞系、 F876L 突变的 22Rv1 细胞系和 L702H 与 T878A 双突变的 MDA-PCa-2b 细胞系中的AR蛋白降解（ >80% ），且在四个AR + 细胞系中均具有优异的最大降解率（ > 95%）。

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ARD-2585 的合成路线如图所示（ Scheme 5 ）。化合物 66e 在HATU和DIPEA处理下与化合物 73e 发生缩合反应得到化合物 82e ， 82e 经经TFA脱除氨基保护得到化合物 83e ； 83e 在碱性条件下发生亲核取代反应得到最终化合物 43 。

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小结：王少萌教授团队基于先前报道的化合物发现了高活性和口服生物利用度优异的 PROTAC AR 降解剂，展现出一定的临床潜力，未来或许有望进入市场，为治疗耐药性前列腺癌提供了新的治疗手段。

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参考文献：

[1]Rathkopf, D.; Scher, H. I. Androgen receptor antagonists in castration-resistant prostate cancer. Cancer J. 2013, 19, 43-49.

[2]Salami, J.; Crews, C. M. ; et al. Androgen receptor degradation by the proteolysis-targeting chimera ARCC-4 outperforms enzalutamide in cellular models of prostate cancer drug resistance. Commun. Biol. 2018, 1, 100.

[3]Hwang, D.-J.; He, Y.; Ponnusamy, S.; et al. New generation of selective androgen receptor degraders: our initial design, synthesis, and biological evaluation of new compounds with enzalutamide-resistant prostate cancer activity. J. Med. Chem. 2019, 62, 491-511.

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.1c00900