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CRISPR基因组编辑技术自报道以来发展迅速，被广泛应用于哺乳动物细胞的基因组编辑，在基因遗传病的治疗中展现出巨大的发展潜力。除了目前使用最为广泛的Cas9之外， Cas12a核酸酶由于其具有与Cas9不同的识别区域序列和显著更低的脱靶率而受到人们的广泛关注，尤其是临床治疗相关领域有望成为比Cas9更为安全的基因编辑工具。然而，由于Cas12a系统的基因编辑效率较低，极大的限制了其应用前景，因此改善Cas12a系统的基因组编辑效率，是一个亟待解决的科学问题。

2021年10月13日，北京大学刘涛团队在Molecular Cell上发表了题为Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates的研究论文，制备了共价Cas12a-crRNA复合物，有效提高了基于Cas12a系统的基因编辑效率。

CRISPR编辑系统由蛋白质和核酸两个部分组成：核酸酶Cas蛋白负责切割基因组DNA，向导RNA（crRNA）则通过碱基互补配对的方式引导核酸酶到指定基因组位点进行切割。针对CRISPR-Cas12a系统基因编辑效率底下的问题，刘涛团队提出了蛋白质核酸共价偶联复合物的设想，既通过生物正交反应实现Cas12a与crRNA的共价交联，从而将基因编辑中Cas12a、crRNA与基因组DNA之间的三分子反应转化为两分子反应，来实现编辑效率的提升。然而如何实现蛋白质与RNA共价偶联且不影响其构型和活性是该设想得以实施的关键。针对这一问题，刘涛团队利用基因密码子扩展技术，结合蛋白晶体结构分析，在Cas12a核酸酶上合适位点特异性引入了含有叠氮基团的非天然氨基酸，该修饰并不会影响Cas12a的活性与物理化学性质，且可以与5’端修饰DBCO的crRNA共价偶连。试验表明，该共价偶联策略，在不同类型细胞中都显著地提高了Cas12a系统的基因编辑效率，且不会显著引起脱靶。在此基础上，作者将该技术应用于CAR-T细胞的高效制备（图1），有望推动新一代更安全可控的免疫细胞制备。该研究将Cas12a与crRNA分子通过生物正交反应共价偶联，为Cas12a系统的广泛应用奠定了基础，并为其他低效的Cas核酸酶改造提供了思路与方法。

图1 定点修饰Cas12a共价偶连crRNA提高Cas12a系统基因组编辑效率

作者首先基于Cas12a的晶体结构，利用基因密码子扩展技术将含有叠氮基团的非天然氨基酸定点引入了Cas12a蛋白中，其与末端修饰DBCO的crRNA偶连可以实现共价Cas12a复合物（conjugated Cas12a, cCas12a）制备，并证明在特定位点偶联的复合物不会影响编辑。在细胞实验中发现，相较于野生型 Cas12a，cCas12a可有效提高不同细胞系中不同位点的基因组编辑水平，且在保持高效靶向效率的情况下，并无明显脱靶效应的增加。

CAR-T细胞治疗的出现掀起了免疫治疗的热潮，对多种癌症尤其是血液癌的治疗展示出了良好的治疗效果。目前临床多采用病毒的方式将CAR基因导入T细胞中，由于基因随机整合至T细胞基因组中，因此存在转录沉默、细胞癌变、异常增殖等风险。利用基因编辑技术联合同源重组将CAR基因定点整合至T细胞特定基因座中则提供了一种更为安全的CAR-T细胞制备方法，推动了新一代细胞治疗的工程改革。在该研究中，作者采用电转的方式将Cas12a-crRNA共价复合物导入原代T细胞中，对内源性TRAC基因进行定点敲除，随后通过AAV将CAR基因导入T细胞中，促使CAR基因定点重组至TRAC基因座中，作者通过该方法提供了一种高效制备定点整合CAR-T细胞的策略，且所制备的 CAR-T细胞具有良好的抗肿瘤效应。

考虑到目前临床上多采用自体T细胞进行免疫治疗，但由于患者体内T细胞质量及数量限制限制了其发展，因此作者利用cCas12a进行了T细胞中多重基因编辑，同时敲除了内源性TRAC, β-2 microglobulin (β2M), PD1 与 CTLA4基因，同时在TRAC位点定点敲入了CAR基因，从而实现抵抗PD1与CTLA4抑制的、定点整合的通用型CAR-T细胞制备。结果表明，相比于WT Cas12a，cCas12a在双位点、三位点、四位点基因敲除中都具有更高的敲除效率，可以实现通用型CAR-T细胞的高效制备。

综上所述，北京大学药学院分子与细胞药理学系刘涛研究员团队利用基因密码子扩展技术定点修饰Cas12a蛋白，进而与末端修饰DBCO的crRNA分子共价偶连，制备了共价Cas12a-crRNA复合物，有效提高了基于Cas12a系统的基因编辑效率，并用于定点整合CAR-T，为Cas12a的广泛运用及临床研究奠定了基础。

刘涛课题组19级博士生凌鑫宇与20级博士生常丽颖为该论文的共同第一作者，刘涛研究员为通讯作者，北京大学生命科学学院胡家志研究员为该研究在脱靶检测方面提供了帮助。值得一提的是，在前期研究中，刘涛课题组利用类似的策略实现Cas9基因编辑体系中同源重组效率的大幅提升（Science Advances2020, 8;6(15):eaaz0051）。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.09.021