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Greengard提出颠覆性理论之学术背景
为理解Greengard的研究，我们还需要先来重温一下糖原合成和代谢的基础生化知识。糖原（glycogen）是葡萄糖（glucose）的聚合物大分子，是葡萄糖的储存方式。在我们饱餐一顿之后，血糖水平升高，胰腺分泌胰岛素（insulin），胰岛素促进葡萄糖合成糖原，储藏于肝脏和肌肉中，降低血糖水平。
当血糖下降时，胰腺分泌胰高血糖素（glucagon），促进糖原分解，释放葡萄糖，提高血糖水平；或在应激情况下，如面对恐惧或危险时，肾上腺素（adrenaline）水平飙升，促进肌肉分解糖原，释放葡萄糖，进入战斗或逃跑状态。
图15. 糖原合成（左）和分解（右）的关键步骤。
胰岛素激活磷酸酶，磷酸酶去磷酸化，激活糖原合成酶，促进糖原合成；胰高血糖素和肾上腺素激活cAMP下游激酶，激酶磷酸化，激活糖原磷酸化酶，促进糖原分解。另外图中未标出来：胰岛素激活的磷酸酶同时也可以将糖原磷酸化酶去磷酸化，抑制糖原分解；胰高血糖素和肾上腺素激活cAMP下游激酶，同时也可以将糖原合成酶磷酸化，抑制糖原合成（作者绘图）。
这些过程中涉及到很多催化酶反应，大多是由上文提到的科里Cori夫妇及他们的弟子发现的。Cori夫妇首先发现了糖原代谢的第一中间产物葡萄糖-1-磷酸（glucose 1-phosphate，也称Cori ester酯），Greengard的导师之一Cori夫妇的第一个博士生Colowick 在Cori夫妇指导下发现糖原磷酸化酶（glucogen phosphorylase）。
葡萄糖-1-磷酸同时也是糖原合成的最后中间产物，反过来的反应由糖原合成酶（glycogen synthase）催化。而胰岛素、胰高血糖素和肾上腺素则是通过磷酸化（在蛋白上加上一个磷酸基团）和去磷酸化（从蛋白上移走一个磷酸基团）修饰这些酶来激活或抑制这些酶，从而调控糖原合成和分解。
Greengard的另一位导师（也是Cori的弟子）Sutherland则发现胰高血糖素和肾上腺素通过激活另一个酶——腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC），从而激活cAMP信号通路。他认为所有的激素都是通过激活cAMP信号通路来发挥作用，并将cAMP称为“第二信使”。Sutherland因此独享了1971年的诺贝尔生理学或医学奖。
在Greengard成立实验室的1968年，Cori的另一个弟子Edwin Krebs（和线粒体三羧酸循环系统的Krebs不是同一人）和他的合作者Edmond Fischer发现cAMP激活PKA激酶，并系统的阐述了胰岛素等激素如何通过激活激酶（kinase，在蛋白上加上一个磷酸基团）和磷酸酶（phosphatase，从蛋白上移走一个磷酸基团）来实现上述磷酸化和去磷酸化过程，最终调控糖原合成和分解。Krebs和Fischer共享了1992年的诺贝尔生理学或医学奖。
图16. 激酶和磷酸酶分别通过对蛋白磷酸化和去磷酸化来调控酶活、相关的生化反应和细胞活性。
蛋白磷酸化和去磷酸化是个动态平衡的过程（作者绘图）。
Greengard猜测，慢神经反应跟激素介导的机制类似，只不过在代谢系统，胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素等是从远处释放，经血液循环到达目的地和受体结合，而神经递质则在几十纳米宽的突触前细胞膜释放，与突触后细胞膜表面的受体快速结合。
进化从来不是一个重新设计的过程，而是将已有的东西重新利用起来。神经系统重新利用了代谢系统的这一机制。这也是为什么慢反应的受体被称为代谢型受体。Greengard的想法在现在看来再正常不过了，但在当时看来实在太另类了。据Greengard回忆，当时他的朋友们都觉得他疯了，劝他早日回归主流研究。
“Greengard Cascades”：级联，滚滚而来的新发现
证明自己理论的第一步，Greengard需要证明神经系统中存在着代谢系统中Sutherland命名的“第二信使”cAMP。其实Sutherland等人在研究cAMP的时候就已经发现，在所有物种中，合成cAMP的腺苷酸环化酶AC活性在大脑中最高43。但cAMP在脑中的功能，其生理生化效应还没人研究。在成立实验室的第二年（1969年），Greengard发表了第一篇Science文章，用Sutherland和Krebs研究激素诱导糖原分解相同的方法，发现大脑中确实存在大量cAMP，且其生化效应确实也能激活cAMP依赖的PKA激酶44。
这年夏天，有两个大四学生想去Greengard实验室做毕业设计。一般实验室不太喜欢没实验经验的大学生，但Greengard刚好缺人手，就招了他们。这两个人一个毕业后留在实验室读博士，一个去了哈佛大学（Harvard）读博士。这个离开的小伙子叫Josh Sanes。Sanes说这是他做的一个糟糕的决定。在哈佛大学，神经科学家都笑话Greengard，在他们看来，大脑高度耗能，大量消耗葡萄糖，自然也就有cAMP，仅此而已45。
要知道当时的哈佛神经生物学系是世上第一个神经生物学系（于1966年成立），甚至神经生物学（neurobiology）这个名字可能都是创系主任、现代神经科学的集大成者Stephen Kuffler在给系起名的时候想出来的。Kuffler将生理学、解剖学和化学的方法统一运用于神经科学的研究。
系里的神经科学家都是传统的电生理学家，包括上文提到的研究视觉系统20多年的Hubel和Wiesel（Wiesel于Kuffler之后任系主任，后于1983年和Greengard同年去了洛克菲勒大学，几年后任校长。在我国成立生命科学改革试验单位北京生命科学研究所NIBS时，Wiesel还作为学术委员会主席参与了评估）。那年（1970年），Greengard也去哈佛神经生物学系作了报告，大家都同意cAMP信号通路在大脑代谢里的作用，但没人相信Greengard的理论——cAMP在神经传递中也起着作用。历史总是惊人的相似，当年“放电派”的Fulton也是说“化学派”研究的乙酰胆碱只是代谢副产物。回来后，Greengard决定结合生理学，用实验来回应他们的质疑。
Sanes与“脑彩虹”技术
Sanes现在是哈佛大学教授，“脑彩虹（Brainbow）”的共同发明者之一。著名华人神经科学家、麻省理工大学教授冯国平曾师从Sanes。
图17. Brainbow技术由几种荧光蛋白随机组合，从而使不同神经细胞被不同荧光所标记。
图中所示为海马区每个神经元表达不同荧光。图片来自Sanes实验室。该技术由哈佛大学Jeff Lichtman和Sanes共同于2007年发明46。读者如果感兴趣，可以从Cell杂志网站欣赏更多漂亮的Brainbow图片（https://www.cell.com/pictureshow/brainbow）。
做任何研究，首先要建立好的研究方法。这实验室第一篇Science的第二作者是实验室助理教授、中国台湾籍科学家郭智化（Jyh-Fa Kuo），现为埃默里大学（Emory）荣誉退休教授。郭比较了多个物种（包括脊椎动物和无脊椎动物）不同组织，发现都存在着cAMP依赖的激酶酶活，并系统地研究了酶活条件、建立了灵敏的检测酶活方法47。
用郭新建立的方法，Greengard等人还发现了更多的“第二信使”。郭通过比较不同的环腺苷酸，发现在龙虾肌肉组织中cAMP（环腺苷酸）和cGMP（环鸟苷酸）各自激活其特异性的下游激酶，证明cGMP和cAMP一样可以作为细胞信号的“第二信使”48。后来Greengard等人还发现了第三类“第二信使”，由钙离子激活的下游信号，包括与钙结合的calmodulin和其下游激活的大脑特异性的CaMKII激酶49。
CaMKII在神经突触可塑性、学习记忆中都有重要作用，后来和Greengard共享诺贝尔奖的Eric Kandel和麻省理工学院（MIT）由研究免疫转而研究神经科学的日本科学家Susumu Tonegawa在这方面都有重要贡献。CaMKII也是现在非常常用的神经元启动子，在皮层锥体神经元、纹状体的多棘投射神经元SPNs等特异性表达。
图18. 神经细胞信号通路及三个“第二信使”（cAMP，cGMP，钙）（作者部分汉化）50。
对神经科学家而言，在体外试管里做的生化反应没什么意思，有意思是在体内生理条件下发生的生化反应。对Greengard来说，当时最重要的工作就是去证明cAMP水平是否在生理条件下受神经活性调控，以及去寻找受神经递质激活的腺苷酸环化酶AC（类似于在代谢系统中由激素激活的腺苷酸环化酶AC）。
这次，他要将生理学的方法和生物化学的方法相结合，从生理学的角度去研究活的放电的神经细胞发生的化学反应，从生化学的角度去研究化学反应在神经交流中的作用。1971年，Greengard发表了两篇Science文章，分别回答了上面的两个问题。
第一篇文章里，Greengard等人先用生理学的方法分离了兔的颈上交感神经节（superior cervical ganglia，SCG），并对其做接近生理条件的刺激，然后用Brodie的方法提取cAMP，最后用郭之前建立的高灵敏度的方法检测酶活，最终证明生理条件下的神经细胞活性确实能刺激cAMP合成及激活下游激酶51。也就是说，神经活性诱导的细胞信号通路和代谢系统激素诱导的信号通路是一样的。
那么，它的机制是不是也是一样的呢？神经活性是否也是通过激活腺苷酸环化酶AC来刺激cAMP合成？在第二篇文章中，Greengard和他的学生John Kebabian重复兔颈上交感神经节刺激实验，最终找到了受神经递质多巴胺激活的腺苷酸环化酶AC，提示颈上交感神经节中可能存在着释放多巴胺的中间神经元，但最重要的是，他们首次发现多巴胺是通过提高cAMP水平来调控神经细胞活性52。这也是Greengard第一次涉足多巴胺研究。
如第二期文章介绍，在Carlsson、Hornykiewicz等人的努力下，当时的科学家们已经知道多巴胺是种独立的神经递质，其在纹状体的释放对运动调控至关重要，多巴胺缺失可导致帕金森症。但多巴胺是如何调控纹状体细胞活性的却未知。Greengard的发现提供了可能的机制，于是他开始研究纹状体。次年（1972年），Greengard和Kebabian等人证实，在纹状体中，多巴胺确实也能激活AC-cAMP-激酶信号通路53。
1976年，Van Rossum正式提出精神分裂症的“多巴胺理论”时，指出存在两种多巴胺受体，当时的命名沿用去甲肾上腺素受体命名，分别为alpha和beta受体，alpha激活神经细胞，beta不能。1979年，为避免混淆，Kebabian等人将其改为多巴胺一型和二型受体54。后来的研究陆续发现在其他组织及纹状体中，多巴胺二型受体事实上不是不能激活，而是抑制AC-cAMP-激酶信号通路及纹状体细胞活性。
现在我们知道，纹状体多棘投射神经元（spiny projection neurons，SPNs）主要表达两种多巴胺受体：一型D1Rs（含D1和D5两个亚型）和二型D2Rs（含D2、D3、D4三个亚型）多巴胺受体。两种多巴胺受体都是七重跨膜的G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors，GPCR），五重、三重跨膜等就目前所知是没有功能的。G蛋白根据其alpha亚基不同主要有三种，和多巴胺受体相关的是Gs（s是stimulate，表示刺激、激活）和Gi（i是inhibit，表示抑制）两种。
一型受体D1Rs是Gs蛋白偶联的受体，通过激活腺苷酸环化酶AC，刺激cAMP信号通路，提高细胞活性；二型受体D2Rs则刚好相反，是由Gi蛋白偶联的受体，通过抑制腺苷酸环化酶AC而抑制cAMP信号通路，抑制细胞活性（图18）。
图19. 多巴胺信号通路简图。
可以看到长长的受体蛋白在细胞膜上来来回回跨进跨出共7次。当受体和多巴胺结合后，便会激活下游Gs或Gi通路，分别激活或抑制细胞活性（作者绘制）。
对生物学研究而言，最重要的永远是功能、功能、功能（重要的事说三遍）。1971年发表的Science文章里， Greengard等人通过对兔的颈上交感神经节的突触前刺激，发现突触后细胞cAMP水平升高了，直接证明cAMP水平在生理条件下受神经活性调控。那么下一步自然是去证明是否cAMP水平变化能介导突触后细胞的活性、调控生理学功能。
这次Greengard等人通过直接加入cAMP，或用药理学的方法改变（提高或降低）cAMP水平来检测其对神经活性的影响。次年（1972年），Greengard等人再发Science文章，发现颈上交感神经节的突触前刺激可以在突触后细胞先诱导一个快速反应的兴奋性突触电压（EPSP），紧接着一个慢反应的抑制性电压（slow-IPSP）；而通过调控cAMP水平，则可改变这个慢反应的突触抑制性电压（slow-IPSP），从而改变神经细胞活性55。1971和1972年的这两篇Science文章足以证明cAMP介导由多巴胺等神经递质引起的慢反应。
1972年，Greengard还和钱永佑（Richard Tsien）合作，用相同的方法，但是研究cAMP对心脏浦肯野纤维（cardiac Purkinje fibres）活性的影响56。这次的神经递质不是多巴胺，而是肾上腺素。肾上腺素对浦肯野纤维动作电位的影响是首先去极化上升更高，其次电压复极化下降更早；前者主要是由钠和钙离子参与的缓慢内向电流介导，后者由钾离子外向电流介导。钱永佑是钙离子通道的专家。与颈上交感神经节类似的，cAMP可模拟肾上腺素对浦肯野纤维动作电位的影响，扩大纳／钙离子缓慢内向电流和钾离子外向电流，使动作电位去极化更强，复极化更早。
钱永佑
钱永佑是著名的神经科学家，钱学森之侄，钱永健（Roger Tsien）的大哥（钱永健因对荧光蛋白GFP的研究而获2008年诺贝尔化学奖）。钱永佑在中国出生，两岁随父母移民美国。大学和硕士就读于麻省理工MIT电子工程专业，硕士毕业后获罗德奖学金（Rhodes Scholarship，最负盛名的国家奖学金之一）去牛津大学读博士。博士期间和Hodgkin有过交流57。在牛津获得博士学位后，钱永佑于1970年（晚Greengard两年）在耶鲁大学建立实验室。钱永佑现为纽约大学神经科学和生理学系系主任。
图20. 钱永佑（Richard Tsien）（图片来源自纽约大学官网）
钱永佑培养了很多优秀的神经科学家，包括改进光遗传技术并作出重要贡献的Karl Deisseroth和Edward Boyden，上文提到的Raman的导师Bruce Bean，浙江大学胡海岚、清华大学时松海和冷泉港李波等人的导师Roberto Malinow，胶质转分化神经再生领域的陈功，还有年轻一辈如波士顿大学韩雪、北京大学李毓龙、浙江大学马欢、中山大学李勃兴等。
Greengard在1971年的两篇文章用生理学的方法去刺激神经递质传递，用生物化学的方法去检测cAMP水平变化。1972年的两篇文章则是用生物化学的方法去调控cAMP水平的变化，用生理学的方法检测细胞活性的变化。将不同的方法通过不同的方式结合，换一个组织、换一个细胞、换一个药物、换一个刺激强度，每一篇都是重量级的文章，似乎随便怎么做都是重要的发现，这或许从侧面反映了一个新的领域的开启。
从1969年发表第一篇Science到1978年，成立实验室的第一个十年里，Greengard发表了一百多篇文章，其中11篇Science，9篇Nature（其中第一篇为Nature New Biology，当时的Nature三大期刊之一，后来并入Nature，第一作者是钱永佑，就是上面提到的记录心脏浦肯野纤维的文章）。
这十年的研究中，Greengard等人主要系统研究了不同物种的不同组织中cAMP和cGMP激活的PKA和PKG激酶活性，对神经细胞活性的调控等。另外，磷酸化／去磷酸化的化学反应除了介导神经传递慢反应、调节突触后细胞活性外，还能调控神经传递、影响突触前神经递质释放。
Greengard等人发现PKA在大脑中的第一个底物，命名为Protein I（典型Greengard风格，简洁明了），后来发现Protein I主要在突触中（突触前细胞的轴突末端“手指尖”），改名为Synapsin I。Synapsin I 在神经递质的传递中有重要作用。神经递质以“泡泡”形式储存。在轴突末端其实有两个“泡泡”库，一个贴近膜的“随时释放库”，神经细胞一放电就释放神经递质，一个远离膜的“保留库”，当“随时释放库”不足的时候补给“泡泡”。Synapsin I被cAMP激活的PKA激酶磷酸化是实现这个补给作用的关键一步。这一系列研究奠定了Greengard获诺奖的基础。
之后，大批的年轻人涌入Greengard的实验室。接下来几十年，Greengard的研究全面开花，几乎在每一个方向都有深入的发展，包括PKA、PKG、和其他激酶，如CaMKII、及磷酸酶、Synapsin I和其它磷酸化/去磷酸化底物、多巴胺受体及其它神经递质受体信号通路。因多巴胺在精神分裂症、帕金森症、毒品成瘾、多动症等疾病中的重要作用，多巴胺信号通路也成了Greengard实验室的一个研究重点，并最终发现了一个在纹状体高度表达的、整合多巴胺和其他信号的主调控因子DARPP-32 （dopamine and cyclic AMP regulated phosphoprotein MW=32 kDa，多巴胺和cAMP调控的32千道尔顿大小的磷酸化蛋白）。
这一系列的研究，毋庸置疑地证明了Greengard最初的想法是对的，神经传递的慢反应跟代谢系统激素介导的反应是一样，通过第二信使、激酶／磷酸酶的磷酸化／去磷酸化级联（cascades）反应来调控离子通道活性、神经递质受体活性、基因表达等来最终实现对神经细胞活性的调控。这些便是他获诺贝尔奖的主要贡献。
图21. 在纹状体SPN神经细胞里，多条信号通路汇集在主调控因子DARPP-32，
通过磷酸化和去磷酸化调控DARPP-32活性及下游效应58。
未完待续……
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