撰文 | 木兰之枻
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CRISPR-Cas系统为代表的基因编辑技术让基因治疗研究飞速发展，其中CRISPR-Cas为基础的单碱基编辑工具CBE和ABE可实现A·T--G·C和C·G--T·A碱基对的精准转换，理论上可治疗近半数点突变遗传病，因而在基因治疗领域有广阔的应用前景。除基因编辑工具外，基因治疗领域的另一关键技术难题是有效的递送与运载技术（Nat Biotech综述 | 基因编辑治疗离我们还有多远？——论有效的递送方式）【1】，其中代表性的技术包括基因治疗前景喜人的腺相关病毒（AAV）载体及用于核酸和蛋白质递送的脂质纳米颗粒和其他非病毒类载体。近年来，可实现mRNA有效递送的类病毒样载体技术取得多种突破，并被用于CRISPR-Cas相关基因编辑体系的递送和基因治疗研究（蔡宇伽团队发明一种介于病毒载体与非病毒载体之间的类病毒体递送技术；NBT | 蔡宇伽/洪佳旭团队发布首个基于类病毒-mRNA技术的体内基因编辑治疗的临床前研究；Science | 张峰团队开发RNA递送工具——哺乳动物逆转录病毒样蛋白PEG10通过内源性蛋白假型化完成功能性mRNA递送）【2-4】。与DNA/RNA为基础的递送技术相比，用于治疗性蛋白/核糖核酸蛋白（RNP）复合物有效递送的技术可实现治疗性蛋白的瞬时表达，这可降低蛋白的潜在毒性，因而能大幅提升基因治疗的安全性。不过目前用于治疗性蛋白/蛋白复合物体内有效递送的新技术研究进展缓慢，仍有待新的突破研究。
2022年1月11日，美国哈佛大学刘如谦（David Liu）实验室在Cell杂志上发表了题为Engineered virus-like particles for efficient in vivo delivery of therapeutic proteins的论文。文章以逆转录病毒为基础进行多重改造优化，成功获得类病毒样蛋白递送体系eVLPs，可用于基因编辑蛋白RNP复合物的体内高效递送。优化后的第四代eVLPs可实现治疗性蛋白RNP复合物向原代细胞和小鼠多种组织的高效递送，并在多种疾病模型中取得了良好的治疗效果。此外，与DNA递送体系AAV病毒系统或质粒系统相比，eVLPs的脱靶效应明显降低并接近本底水平，这证实了eVLPs的安全性。
早期研究指出，将目标蛋白融合于逆转录病毒gag蛋白的C末端，可将目标蛋白包裹进逆转录病毒颗粒，从而实现有效递送。多个实验室曾成功将该技术用于Cas9蛋白RNP复合物的递送【5,6】，但该策略在单碱基编辑工具蛋白RNA复合物的递送效果仍有待验证。为此研究者将单碱基编辑工具ABE8e融合于FMLV逆转录病毒的gag蛋白C末端，两者之间有连接肽介导，由此开发出的工具命名为v1 BE-eVLP蛋白递送系统。逆转录病毒颗粒成熟过程中，连接肽会被FMLV蛋白酶切割，从而释放ABE8e蛋白RNP复合物。研究证实，该策略可实现功能性ABE8e蛋白复合物在细胞内的高效递送并实现目标位点的精准编辑。不过在血红蛋白病的治疗性位点BCL11A增强子区域，v1 BE-eVLP系统的编辑效率仍有很大的提升空间。
考虑到连接肽的切割效果对ABE8e蛋白RNP复合物的有效释放至关重要，这会影响后续的基因编辑效果，因此研究者对连接肽体系进行了优化。逆转录病毒MMLV中蛋白酶对连接肽的切割机制研究更为深入，研究者首先将FMLV系统替换为MMLV系统，随后优化连接肽序列以改造BE-eVLP系统。筛选后的v2.4 BE-eVLP系统有更优的碱基编辑效率。
单碱基编辑工具中会添加入核信号NLS以增强其入核能力和碱基编辑效率，但逆转录病毒颗粒的包装发生在细胞质中，因此入核信号NLS会干扰BE-eVLP系统的包装效率。为此研究者在v2.4 BE-eVLP系统的基础上，通过添加出核信号NES以提升逆转录病毒颗粒的包装效果。研究发现将3xNES序列融合于MMLV gag蛋白与连接肽之间获得的v3.4 BE-Evlp系统有更优的碱基编辑效率。
此外，逆转录病毒包装过程中，不同包装质粒间的化学计量比也会影响BE-eVLP系统的编辑效果。研究者发现，MMLV的gag–pro–pol辅助质粒与gag-3XNES-ABE8e质粒的摩尔比例为1:3时获得的v4 BE-eVLP系统有最佳的碱基编辑效率。
通过对连接肽、出核信号NES以及各包装质粒化学计量比的优化，研究者最终获得v4 BE-eVLP蛋白递送系统。该系统在血红蛋白病的基因治疗位点BCL11A增强子的编辑效率提升至95%。此外， v4 BE-eVLP系统在小鼠来源的3T3细胞系及人源的HEK293T细胞系中的多个位点处均能实现高效精准的碱基编辑，并可同时实现多位点的高效精准编辑。通过改变逆转录病毒包装时所用的包膜糖蛋白，研究者还可改变BE-eVLP系统对细胞的选择性，从而实现治疗性蛋白的细胞特异性递送。
单碱基编辑工具在应用中最引人关注的安全风险是DNA水平的脱靶效应。蛋白RNP复合物的直接递送可减少其在细胞内的存留时间，因此有望降低脱靶效应及安全风险。研究发现，与传统的质粒转染相比，v4 BE-eVLPs蛋白递送系统在DNA水平的多种脱靶效应均有明显降低，且接近本底水平，这表明v4 BE-eVLPs系统在安全性上有明显提升。
为进一步证实v4 BE-eVLPs蛋白递送系统的应用前景，研究者在各类原代细胞中验证了系统的编辑效果。研究指出，v4 BE-eVLPs系统能有效修复患者和小鼠模型来源的原代成纤维细胞中的致病点突变，其修复效率>95%。在人原代T细胞中，v4 BE-eVLPs系统能同时编辑B2M和CIITA两种基因的剪接位点，从而破坏其表达。
最后，研究者在小鼠中验证了v4 BE-eVLPs蛋白递送系统的体内编辑效果。研究者首先在P0小鼠的脑室注射v4 BE-eVLPs系统，发现在小鼠中枢神经系统中能实现目标位点的高效精准编辑（阳性细胞编辑效率>50%）。研究者还在6-7周龄小鼠中通过后眼窝注射在小鼠肝脏中成功的编辑了Pcsk9基因的剪接位点（编辑效率为63%），编辑后1周小鼠血清中Pcsk9蛋白水平降低了78%，证实了编辑的有效性。此外，研究者还在4周龄rd12失明小鼠模型中通过视网膜下注射证实，v4 BE-eVLPs系统能有效修复小鼠模型中的致病点突变并部分恢复其视力。研究还指出，在小鼠体内的基因编辑过程中，v4 BE-eVLPs系统在DNA和RNA水平的脱靶风险均明显降低，甚至接近本底水平。
总体而言，本研究以逆转录病毒为基础，成功地开发出类病毒样的蛋白递送工具eVLPs，实现了治疗性蛋白/蛋白RNP复合物在细胞和动物体内的高效安全递送。研究指出，eVLPs介导的单碱基编辑工具蛋白RNP复合物递送可在细胞和动物水平实现高效安全的基因编辑。虽然eVLPs蛋白递送系统依然有诸多不足有待进一步的改进和优化，但全新的蛋白体内递送系统让基因治疗的递送难题有了新的解决思路。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.12.021
参考文献
1. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O.J. et al. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nat Biotechnol 38, 845–855 (2020).
2.Ling, S., Yang, S., Hu, X. et al. Lentiviral delivery of co-packaged Cas9 mRNA and a Vegfa-targeting guide RNA prevents wet age-related macular degeneration in mice. Nat Biomed Eng 5, 144–156 (2021).
3. Yin, D., Ling, S., Wang, D. et al. Targeting herpes simplex virus with CRISPR–Cas9 cures herpetic stromal keratitis in mice. Nat Biotechnol 39, 567–577 (2021).
4. Segel, M. et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. Science 373, 882–889 (2021).
5. Hamilton, J.R., et al. (2021). Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Rep 35, 109207.
6. Mangeot, P.E., et al. (2019). Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nat. Commun. 10, 45.
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