概述

新冠疫情不断蔓延，核酸检测在疫情的防控中发挥着至关重要的作用。为了监测“提取、扩增”等环节，目前市场上已有多个产品均在核酸扩增试剂内加入了“内标”，包括“内源性内标”和“外源性内标”，两种方式各有利弊。

“内源性内标”的一个优势就是可监测“采样”[1]。这样的说法并不能完全囊括所有的临床场景；例如：在“单检”过程中，内源性内标仅能监测采集到足够人体细胞，不能判断采样部位是否正确；其次，在大规模“混检”中，标本漏检也难以发现。

因此，在实际工作中应根据实际情况，选择合适的试剂；并且无论使用哪种内标的扩增试剂，都需要保证采用过程的规范化。

“内标”、“内源性内标”和“外源性内标”是什么

在检验工作中，如PCR扩增靶标基因扩增呈现“阴性”，存在哪些可能性呢？

可能受试者为“真阴性”，也可能是由于采样、提取和扩增阶段存在问题，导致的“假阴性”[2]。各个厂家为了减少“假阴性”的发生率，通过改变核酸扩增试剂的配置，可通过检测内标核酸是否“起线”，判断是否存在“采样、提取、扩增”导致的假阴性。

内标分为“内源性内标”和“外源性内标”，两者的分析比较如下表[3]:

“外源性内标“可更好监测提取、扩增过程：

外源性内标是在扩增体系中的提前加入的“定量”核酸分子，扩增中Ct值的变化幅度较小（某产品内标Ct值为：30±1），因此当外源性内标扩增Ct值明显变大时，提示核酸提取不足，或反应体系中存在抑制物等。

然而内源性内标是人体的管家基因，随着采集的人体细胞加入反应体系，扩增反应的Ct值较大时，可能的原因不仅包括核酸提取不足、反应体系中存在抑制物等，也可能是由于并未采集到足够的细胞。

扩增过程中，某样本内标的Ct值升高

可能原因分析

  • 外源性内标：该样本核酸提取不足，或反应体系中存在抑制物

  • 内源性内标：该样本核酸提取不足，或反应体系中存在抑制物，或未采集足量细胞

“内源性内标”起线≠采样成功

试验方案1

纳入了健康志愿者10名，分别口咽拭子采集人体口腔标本，使用“内源性内标”扩增试剂，“内源性内标”扩增结果如下图所示，1~9号样本Ct值为20.0~28.1，10号样本Ct值为24.8；所有样本“内源性内标”均起线，10号样本并未见明显异常。

1~9号样本

Ct值：20.0~28.1

10号样本

Ct值：24.8

事实上，1~9号样本在采样过程中，严格按照SOP操作采样，可以认为是采样成功的样本。10号样本取样未按SOP操作，采样拭子仅碰及志愿者上颚，可以认为是采样失败的样本。

根据以上实验我们可以认为，在“单检”场景下，“内源性内标”起线，不能说明采样过程合理规范，采样部位准确可靠。

试验方案2

试验对象均为健康受试者，通过采集志愿者口腔标本，制作“10混1”的混检样本共计11个，分别为11~21号样本。所有标本使用“内源性内标”扩增试剂，“内源性内标”扩增结果如下图所示，11~19号样本Ct值为22.8~28.2，20号样本Ct值为25.8，21号样本Ct值为26.0；所有样本“内源性内标”均起线，20号和21号样本并未见明显异常。

11~19号样本

Ct值：22.8~28.2

20号样本

Ct值：25.8

21号样本

Ct值：26.0（点击查看大图）

事实上，11~19号“10混1”的样本中，均加入了10个严格按照SOP操作采样的标本，可以认为是采集成功的样本，并未漏检。而20号样本中混入了1个空拭子，21号样本中混入了2个空拭子，可以认为是漏检了1个或2个受试者的样本。

根据以上实验我们可以认为，在“混检”场景下，“内源性内标”起线，不能说明采样过程合理规范，采样依然存在漏检风险。

小结

综上，“内源性内标”和“外源性内标”扩增试剂各有利弊，我们需要根据具体的应用场景，不同的检测样本，选择合适的扩增试剂。另外“内源性内标”起线，说明采集到了足够的人体细胞，但并不能说明采样规范合理；在新冠疫情依然存在的今天，我们每一个人均应积极配合医务工作人员，保证采样的规范合理，共同为疫情防控努力。

参考文献

[1]关于进一步加强奥密克戎等新型变异株疫情防控工作的通知

[2]Estimating the false-negative test probability of SARS-CoV-2 by RT-PCR. Euro Surveill. 2020 Dec17; 25(50): 2000568.

[3] Reference genes inreal-time PCR. J Appl Genet. 2013 Nov;54(4):391-406.

编辑：刘 煦 审校：陈雪礼