Nature BME：一种具有粘附性和高载药量的坚韧水凝胶促进肌腱愈合

Title:Enhanced tendon healing by a tough hydrogel with an adhesive side and high drug-loading capacity

Authors:Benjamin R. Freedman, Andreas Kuttler, Nicolau Beckmann Sungmin Nam, Daniel Kent, Michael Schuleit, Farshad Ramazani, Nathalie Accart, Anna Rock, Jianyu Li, Markus Kurz, Andreas Fisch, Thomas Ullrich, Michael W. Hast, Yann Tinguely, Eckhard Weber and DavidJ. Mooney

Nature Biomedical Engineering:2022,

DOI: 10.1038/s41551-021-00810-0

引言

肌腱损伤在人体内很常见，常伴有组织炎症和变性；这些损伤也是骨折固定后公认的并发症。尽管已经提出了许多新的手术、康复、移植和药物治疗方法，有些已推向市场，但肌腱愈合失败和持续性疼痛仍有相当大的医疗需求。基于生物材料的新疗法可以通过提供机械支持和有效的时空靶向给药到肌腱组织来解决这些未得到满足的需求。水凝胶的使用可能特别有吸引力，因为它们与周围组织具有普遍的生物相容性，其物理性质的可调性以及它们作为药物输送仓库的能力。然而，水凝胶通常表现出较差的机械韧性和粘附性，依赖细胞渗透或缝合来与周围组织结合，并且经常表现出药物的突发性释放。

在本文中，哈佛大学和诺华公司的研究人员开发了一种坚韧的粘合剂水凝胶，称为 Janus Tough Adhesive (JTA)，在相对表面上具有组织粘附和组织滑动特性，可用作向肌腱输送药物的高容量库。JTA 的高机械韧性是使用双互穿水凝胶网络实现的，该网络结合了藻酸盐水凝胶通过离子键解离来耗散能量的能力，以及高弹性共价交联丙烯酰胺水凝胶，可以在整个网络中分布应力。通过将富含胺的桥接聚合物壳聚糖与消散性海藻酸盐丙烯酰胺水凝胶单侧偶联来实现对组织的粘附。

图文导读

图1.多功能JTA用于肌腱的概述

JTA 水凝胶包含坚韧的水凝胶耗散基质和粘性壳聚糖表面。这种坚韧的水凝胶是通过将钙离子交联的藻酸盐和共价交联的聚丙烯酰胺 (PAAM) 结合起来合成的。除了组织粘附外，该材料还可以促进周围组织的滑动，并用作药物输送系统，用于局部释放诸如曲安奈德之类的药物，如本研究所示。

图2. JTA牢固地附着在不同的肌腱表面

JTA 牢固地粘附在肌腱上，同时支持离体组织滑动。首先研究了JTA对肌腱的粘合强度。通过使用冷冻切片机将组织切割成薄的腱板来制备牛腱样品（图 2a）。在将带正电荷的桥接聚合物壳聚糖应用于坚韧的耗散性海藻酸盐丙烯酰胺水凝胶的一个表面（图 2b）并使该表面与肌腱接触后，壳聚糖迅速扩散到坚韧的水凝胶和肌腱表面（图 2c，d）并产生强粘附力。粘附能量随着时间的推移而增加，在应用后一分钟内超过了纤维蛋白胶 TISSEEL（图 2f）。作为向解剖学较大肌腱转化应用的一步，JTA 的多功能性在猪原位模型中进行了探索。即使在血液存在的情况下，JTA 也能牢固地粘附在猪髌腱、屈肌腱和跟腱（图 2g，h）上。粘附迅速产生，JTA 很好地贴合组织表面。与氰基丙烯酸酯和止血网 相比，JTA 在有血环境中表现出对肌腱的优异粘附，可以针对如骨科手术中可能存在的的情况（图 2i、j ）。

图3. JTA促进肌腱滑动

因为 JTA 仅在一侧粘附于组织，我们测试了 JTA 的相对非粘附侧支持肌腱滑动的能力。摩擦测试表明，非粘附表面在与邻近组织接触时表现出非常低的摩擦系数 (µk)，甚至低于组织接触组织在数百个模拟体内载荷的循环载荷中的值（图 3a-d）。在肌腱-肌腱摩擦测试中，与 JTA 肌腱组不同，在测试结束时会出现对肌腱的损伤。接下来，当用作拇长屈肌上的保护屏障时，在人类尸体手腕中原位检查 JTA 支持滑行的能力（图 3e ）。在这里，JTA 在滑过掌板并穿过腕横韧带时承受了摩擦。 JTA 很好地粘附在拇长屈肌上，并经受住了从掌侧板滑入腕横韧带。

图4 .JTA与肌腱生物相容性好，促进愈合

JTA 具有生物相容性并促进肌腱愈合。为了评估 JTA 在体内的表现，对其髌腱中央中质造成全厚度、部分宽度切除损伤或未受伤的大鼠，要么用 JTA 治疗，要么不治疗（图 4a）。通过应用串行高频超声成像评估 JTA 的厚度以评估任何潜在的肿胀或退化（图 4b ）。此外，损伤降低了肌腱回声，表明胶原蛋白堆积或组织减少（图 4d）。 JTA 改善了受损肌腱的松弛受损（图 4c），但不影响弹性肌腱力学、动态模量（图 4e）。正如预期的那样，肌腱损伤影响了肌腱力学的这些弹性特性。脚趾模量，松弛百分比和tan（δ）不受JTA或损伤的影响。与机械数据一致，发现损伤而不是 JTA 植入会影响肌腱细胞结构和形状（图 4g，h）。在大鼠肩袖模型中进行了体内研究，以评估 JTA 在部分肌腱切开术后与受伤的冈上肌腱附着点的粘附（图 4i )。在这里，JTA 的脚印被扩大以覆盖肩峰并通过肩峰下方以获得额外的结构支撑。植入后，应用串行磁共振成像 (MRI) 评估 JTA 随着时间的推移的解剖位置，并评估炎症组织对 JTA 的反应。 MRI 分析证实，随着动物恢复活动，JTA 的放置在整个研究期间保持不变（图 4j）。为了检查 JTA 是否可以增强肌腱修复，在跟腱断裂模型中研究了有和没有 JTA 植入的肌腱修复的效果（图 4k）。在其 3 周植入期间，JTA 在损伤部位保持原位（图 4l ），与仅修复治疗相比，导致组织形成减少 25%（图 4m）。然而，在 4% 应变下没有检测到动态模量或 tan（δ）的差异。通过将肌腱衍生细胞与 JTA 接触，在体外进一步证实了 JTA 的生物相容性；与 JTA 孵育后，细胞保持高活力（>95%）。

图5 .JTA可在高载药量下实现溶出度控制释放

JTA 能够在计算机计算中和体外实现高载药量和持续药物释放。皮质类固醇曲安奈德(CORT) 的递送被用作模型药物来检查 JTA 的药物装载和释放。首先，使用 Franz 池检查 CORT 通过 JTA 的扩散（图 5a）。与仅支持 JTA 的 PVDF 膜相比，JTA 显著减慢了 CORT 的扩散（图 5b）。坚韧的水凝胶的负载量高达 CORT 溶解度极限的 25,000 倍（图 5c）。通过在交联之前向高粘度藻酸盐丙烯酰胺水凝胶中添加 CORT 微晶悬浮液来完成药物装载。尽管 CORT 被微粉化，但颗粒在高负载（尺寸 > 150 µm2）下在 JTA 中形成较大的聚集体（图 5d ）。添加 CORT 使 JTA 的颜色从透明变为白色。进行有限元（FE）模拟以模拟在充分混合条件下从 JTA 释放 CORT（图 5e）。正如预期的那样，该模型预测药物颗粒依次从外围开始依次溶出，从而导致系统中持续溶出控制的 CORT 释放（图 5e-g ）。模型预测与 JTA 释放的实验观察一致，药物释放以取决于初始 CORT 加载的方式延长 2-10 天（图 5h）。值得注意的是，以 4 倍聚合物含量（500 mgml-1）加载 CORT 的 JTA 仍保持其机械和粘合性能（图 5i，j ）。无论CORT负载如何，暴露于负载CORT的JTA的肌腱衍生细胞的活力在体外仍然很高。

图6 .JTA调节髌腱损伤大鼠模型的血管化和肌腱特性

附着在肌腱上的 JTA 可在体内提供持续的 CORT 释放。为了研究加载CORT的JTA是否可以在体内提供持续释放，在大鼠髌腱损伤模型中进行了研究（图6a）。连续高频超声(HFUS) 分析显示，JTA 在靠近髌腱的位置保持至少 2 周（图 6c ），并通过以下方式确认保持放置死后组织学。血清中 CORT 的定量证实，体外观察到的持续释放也发生在体内 1 周（图 6b）。接下来，使用仓库 JTA 系统，其中圆柱形内部仓库保持高 CORT 浓度（100 mgml-1），两侧和顶部是空白水凝胶。空白 JTA 盖用于进一步支持包含 CORT 的较小 JTA，有效减少 CORT 的净剂量，同时保持高载药量和对肌腱的粘附（图 6j ）。高载药量导致药物溶出时间和药物释放延长。 JTA 在体内大鼠髌腱模型中也具有良好的耐受性。 JTA + CORT 在植入后第 2 天显着 降低血清中的内源性皮质酮水平。 JTA 和 JTA +CORT 具有免疫调节作用，并在损伤后第 2 天显着降低血清趋化因子 GRO-α。 JTA + CORT 还在损伤后第 14 天增加了血清趋化因子RANTESJTA 本身降低了早期愈合中的血管分布水平，而 JTA + CORT 在植入后第 3 天进一步减少了血管分布（图 6d， e ）。损伤后两周，收集髌腱并评估其形态、回声性和生物力学特性（粘弹性、动态和准静态）。与未受伤的肌腱相比，受伤的肌腱回声降低和机械松弛增加（图 6f，g）。相比之下，接受 JTA 或 JTA + CORT 的受伤髌腱与未受伤的肌腱没有统计学差异（图 6f，g）。正如预期的那样，无论JTA植入或CORT递送如何，损伤都会降低动态模量（图6h）。

图7 .JTA在肌腱损伤后诱导免疫调节

获取髌腱的全长图像，以仔细隔离有（图 7a）或没有（图 7b）损伤的中段。肌腱损伤显着增加了肌腱细胞结构，在接受 JTA + CORT 的组中进一步升高（图 7c）。 JTA +CORT 具有免疫调节作用，如 CD68（巨噬细胞）阳性染色的升高所示（图 7d），这表明 M2 巨噬细胞修复表型（Arg-1）（图 7e）。 JTA 单独提高了 CD146 阳性细胞（肌腱干/祖细胞）的比例，但对 CD45（非特异性免疫细胞）、CD31（内皮细胞）、αSMA（肌成纤维细胞）或 iNOS 没有影响（M1 巨噬细胞）染色。 JTA 和 JTA + CORT 在损伤后第 2 周对损伤降低的核纵横比和二次谐波产生 (SHG) 信号没有影响。

小结

提供机械支持和可持续释放疗法的水凝胶已被用于治疗肌腱损伤。然而，大多数水凝胶都不够坚韧，会突然释放药物，并且需要细胞浸润或缝合以与周围组织结合。本文报告了一种水凝胶作为高容量药物储存库，并在一侧结合了耗散的坚韧基质和在另一侧的壳聚糖粘合表面，支持肌腱滑动和对肌腱的强附着力（大于 1,000 J m-2）水凝胶的相反表面，正如我们在循环摩擦载荷期间用猪和人肌腱制剂展示的那样。该水凝胶具有生物相容性，与活体大鼠的髌骨、冈上肌和跟腱紧密贴合，在大鼠跟腱断裂模型中促进愈合并减少瘢痕形成，并在大鼠髌腱损伤模型中可持续释放皮质类固醇曲安奈德，减少炎症，调节趋化因子分泌，募集肌腱干细胞和祖细胞，并促进巨噬细胞极化为 M2 表型。具有“Janus”表面和持续药物释放功能的水凝胶可以设计用于一系列生物医学应用。

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注：本文是“刘壮壮”同学的文献阅读笔记，如有对原文理解不准确的地方请多谅解！

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