Introduction

鸡胚孵化过程中，碳水化合物、脂肪酸、钙和磷等营养物质起着重要作用，所需的营养物质来源于蛋壳、蛋清和蛋黄。这些营养物质通过绒毛尿囊膜（CAM）和卵黄囊（YS）转移到发育中的胚胎

YS的形成从鸡胚发育的第一周开始，到E11将蛋黄覆盖。营养物质通过内吞作用和转运蛋白从卵黄内容物吸收到YS上皮细胞中。CAM在孵化的第5到第6天开始形成，到第11天和第12天完全包围胚蛋内容物。CAM具有三层结构，蛋壳膜相邻的外胚层上皮、富含血管和基质成分的中胚层，以及尿囊腔的内胚层上皮。在孵化期间，CAM是呼吸气体交换、蛋壳钙转运、胚胎酸碱平衡、尿囊液离子和水再吸收的场所。为了更好地了解鸟类胚蛋对营养物质的转运吸收，有大量对YS和CAM的研究。对YS的时间转录组分析证明，在鸡胚发育的最后一周，YS支持或替代肠道，肝脏，以及骨髓等器官的功能。然而，由于CAM具有丰富的血管系统以及鸡胚缺乏完整的免疫能力。因此近年来，大多数CAM的研究都集中于医学相关的血管生成和肿瘤研究。而对于CAM对钙的转运机制没有系统的研究。

鸡胚发育过程中钙的吸收转运至关重要。对CAM功能研究表明，CAM上的特殊细胞分泌酸溶解蛋壳中的碳酸钙，吸收钙离子，为鸡骨骼发育转运80%的钙质。目前，没有确定的数据来阐明钙在CAM中的转运途径，所提出的大多数机制实际上仍然是推测性的。其中，认可度最高是内吞机制。此吸附内吞机制认为CAM转运钙 离子绒毛膜CC细胞的顶端表面对溶解的蛋壳钙的内吞吸收，然后由囊泡介导传递到基底外侧表面。然而，目前并没有明确的数据来确定钙离子的转运机制。

贵州医科大学公共卫生与健康学院食品科学系黄群教授、贵州医科大学校长罗鹏教授等在本文中选择鸡胚发育的四个关键时期E9、E13、E17和E20，对CAM组织进行转录组分析。并结合蛋壳超微结构，绒毛尿囊膜pH变化以及胚蛋钙含量变化来深入了解CAM对钙的吸收、转运机制。

Results

差异表达基因的富集分析

将CAM文库中筛选到的差异表达基因进行GO功能富集和分析。不同发育时期的CAM的差异表达基因被富集到了不同的GO条目，包括细胞周期过程、离子及气体转运过程、离子转运活性、离子跨膜转运体活性及氧结合活性等。

（A）E9 vs E13的GO富集分析；（B）E13 vs E17的GO富集分析；（C）E17 vs E20的GO富集分析。

图1 三组差异表达基因富集的前20个GO条目

为了进一步分析和鉴定CAM差异表达基因参与的生物信号通路，本研究将CAM文库中筛选到的差异表达基因进行通路富集分析。同时，也将CAM的3个比较组的差异表达基因也进行了通路富集分析。

（A）所有差异表达基因的KEGG富集分析；（B）E9 vs E13的KEGG富集分析；（C）E13 vs E17的KEGG富集分析；（D）E17 vs E20的KEGG富集分析。

图2 CAM差异表达基因的KEGG富集分析

基因时序性表达分析

用STEM软件对不同发育阶段的CAM的6378个差异表达基因进行了时序性表达分析，得到了26种不同的基因表达模式。鉴定出了13种显著富集的表达模式。为了探究CAM相似表达模式基因的生物学功能，分别对6个Cluster进行了GO富集分析。Cluster 0中，CAM差异表达基因富集到多个与细胞迁移、增殖分化相关的GO条目；而Cluster 1中，富集到的GO条目与DNA复制、气体转运等有关；Cluster 2中，富集到的GO条目与免疫反应、蛋白质磷酸化、蛋白激酶活性调控相关；Cluster 3中，富集到的GO条目与有丝分裂、细胞周期有关；Cluster 4中，富集到的GO条目与纤毛运动、细胞外转运有关。Cluster 5中，富集到的GO条目与骨生长、乳腺发育有关。

图3 CAM差异表达基因STEM分析

孵化过程蛋壳微观结构变化

通过对蛋壳进行扫描电镜观察可以看出，随着孵化天数增加，横截面平整性变差，乳突层逐渐松散紊乱；与蛋壳形成时期的纤维层相反。孵化期间蛋壳纤维基质的致密性和有序程度逐渐下降，空隙面积越来越大直至消失；随着纤维层空隙变大，乳突层逐渐裸露，乳头消失，留下吸收坑。

（A）孵育前横截面和（D）孵育前内表面；（B）孵育13 d的横截面和（E）孵育13 d的内表面；（C）孵育结束横截面和（F）孵育结束内表面。

图4 蛋壳超微结构

胚蛋的理化性质测定

从E9到胚胎出壳前，CAM的pH从7.5持续下降到6.5，这可能与碳酸酐酶的分泌及其催化产生碳酸有关。胚胎的钙含量随着孵化的进行呈阶段性上升，胚胎的钙含量变化分为3个阶段，E10之前胚胎钙含量较低；E11～E15钙含量增加；E12以后胚胎钙含量约为E10的五倍且持续增加。 胚蛋混合物 钙含量变化趋势与之相符，在E13时显著增加，出壳前达到高峰。说明在孵化过程中，蛋壳作为胚胎的钙质来源，持续且有规律的向胚胎提供生长发育所需的钙质。此外，胚蛋混合物钙含量在出壳前激增的现象与文献报道一致。说明在胚胎出壳前，蛋壳中的钙通过绒毛尿囊膜CAM迅速转移到胚蛋内部，为胚胎出壳后的发育提供足够的钙。

图5 （A）孵育期间CAM的pH变化；（B）胚蛋混合物的钙含量变化；（C）胚胎的钙含量变化

Discussion

观察孵化期间蛋壳的超微结构发现，随着孵化的进行，靠近壳膜的蛋壳乳突层出现明显的矿物溶解、有机基质网络暴露的现象。学者认为蛋壳的矿物溶解是提供溶解通道以促进蛋壳钙的释放。蛋壳基质蛋白调控钙的释放，蛋壳钙释放后，通过CAM转运进入胚蛋供胚胎生长发育。钙含量测定再次表明CAM的钙转运机制在E13时启动。CAⅡ将蛋壳钙释放后，CaBP作为细胞表面的“钙特异性结合受体”，与钙结合后形成囊泡结构，而Ca2+-ATPase作为钙泵将钙离子泵入囊泡。本研究中，不仅发现了CAⅡ的表达，也鉴定到编码Ca2+-ATPase的基因ATP2A3的表达从E9到E20逐步上调。因此，先前研究提出的CC细胞的吸附内吞模型可能是CAM转运蛋壳钙的关键机制。但是，不排除钙通过绒毛膜上皮在CAM中可能共存的不同途径。我们通过分析CAM基因的表达来研究蛋壳钙转移到胚胎的不同机制。分析表明TRPV6和S100A10可能在调控钙转运的启动方面起到重要作用，而RANKL、OPG等基因可能在出壳前调节钙转运的停止。因此，除了吸附内吞机制外，CAM对蛋壳钙离子的转运可能依赖更多的生物调控。

钙是人体必需的矿物质元素，在人体骨骼的形成和代谢中起着重要的作用。全世界约有35亿人缺钙，缺钙已成为影响人类健康的重大国际问题。本研究为进一步研究和阐明鸡胚培养过程中钙的释放和转运机制提供了重要信息。碳酸酐酶在蛋壳钙转运过程中高表达，基于此，推测碳酸酐酶可能是钙释放的关键基因和蛋白，而TRPV6和S100A10可能参与钙转运。此外，TRPV6是人小肠上皮细胞钙吸收的关键蛋白。因此，未来的深入研究将针对这两点进行。在初步阐明鸡胚培养过程中钙的释放和转运机制后，利用食品微胶囊等技术，可以构建一个由钙、钙释放因子和钙吸收转运因子组成的复杂的钙递送系统。这将为实现钙的靶向控释和高效吸收提供新的思路。

Conclusion

本研究对鸡卵孵育期间的CAM进行了转录组分析。在E9、E13、E17、E204个时间点共鉴定到21900个基因，其中DEGs基因6378个。通过功能分析和时间序列分析，CAM的DEGs主要参与离子转运调控、免疫反应和细胞周期等生物过程。CAM通过调节不同孵化阶段不同基因的表达激活和抑制蛋壳内钙转运。本研究结果为进一步探讨与营养转运相关的科学问题提供了科学基础。

作者简介

第一作者黄群

博士、博士后、教授（特聘）、硕士生导师，现为贵州医科大学公共卫生与健康学院食品科学系特聘教授，现任国际食物营养与安全协会理事、中国畜产品加工研究会理事。

主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划子课题（任务）、国家行业专项子课题等国家级课题3项，省级课题2项，参与国家/省部级课题10余项。 主要参与的成果获得省级科技进步（教学成果）奖2项，第一发明人授权国家发明专利10项（转让6项），第一或通讯作者发表SCI/EI收录论文41篇。 国家自然科学基金函评专家， Food Chemistry 、Food Hydrocolloids、 Food Science and Human Wellness 、 Journal of Functional Foods 、 Journal of Agricultural and Food Chemistry 、《食品科学》、《食品科学技术学报》等多家权威期刊审稿人。 主要研究方向为蛋品肉类科学与食品蛋白质化学、食品营养与功能食品、食物资源高值化利用。

通信作者

罗鹏

教授、医学博士、博士研究生导师。贵州医科大学校长，公共卫生与预防医学一级学科及营养与食品卫生学二级学科带头人，兼任中国环境诱变剂学会理事、中华医学会地方病学分会常务委员、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会委员、中华中医药协会中医药现代化联盟副主席、中华地方病学杂志编委。近年来主持国家自然科学基金、国家重点研发计划子课题等项目6项和贵州省各类科技计划项目等20余项。获贵州省科技进步二等奖2项,首届中华医学科技奖1项,贵州省研究生教学成果特等奖1项。在国内外期刊发表研究论文150余篇,参编教材和专著6部。主要研究领域为天然产物的应用与开发。

Transcriptome-based insights into the calcium transport mechanism of chick chorioallantoic membrane

Qun Huanga,b,c,1, Ran Yangb,1, Qia Wangb, Hui Tengb, Hongbo Songb, Fang Gengc,*, Peng Luoa,*

a School of Public Health, The Key Laboratory of Environmental Pollution Monitoring and Disease Control, Ministry of Education, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China

b College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

c Meat Processing Key Laboratory of Sichuan Province, School of Food and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu, Sichuan 610106, China

1 Theses authors contributed equally to this article.

*Corresponding authors.

E-mail address: gengfang@cdu.edu.cn

luopeng@gmc.edu.cn

Abstract

Chorioallantoic membrane (CAM) is responsible for respiratory gas exchange, eggshell calcium transport, embryonic acid-base equilibrium, allantoic ion, and water reabsorption during avian embryonic development. To further understand the timing of CAM gene expression during chick embryonic development, especially the calcium absorption mechanism, transcriptome quantitative comparative analysis was conducted on chick CAM during the embryonic period (E) of 9, 13, 17, and 20 days. A total of 6378 differentially expressed genes (DEGs) were identified. Functional enrichment analysis of DEGs showed that CAM DEGs were mainly involved in biological processes such as “ion transport regulation”, “immune response” and “cell cycle”. Time series analysis of the differential genes showed that the functional cells of CAM began to proliferate and differentiate at E9 and the calcium content of egg embryo increased significantly at E13. Simultaneously, the observation of the ultrastructure of the eggshell showed that the interstice of the fiber layer was enlarged at E13, and the mastoid layer was partly exposed. Therefore, it is preliminarily inferred that CAM calcium transport starts at E13, and genes such as TRPV6, S100A10, and RANKL cooperate to regulate calcium release and transport.

Reference:

HUANG Q, YANG R, WANG Q, et al. Transcriptome-based insights into the calcium transport mechanism of chick chorioallantoic membrane[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(2): 383-392. DOI:10.1016/j.fshw.2021.11.018.

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。