撰文 | 漓
环状RNA（circular RNA，circRNA）是由反向剪接形成的共价闭合单链RNA分子，其在真核细胞转录组中普遍存在（毕竟原核生物没有内含子/外显子的概念）。越来越多的研究揭示circRNA可调控基因的表达，因此受到广泛的关注。目前也可以在体外进行合成，并通过一系列的实验进行验证，比如凝胶电泳、Northern Blot、RNase R消化、高效液相色谱等。
以往研究，比如2017,2019年Molecular Cell上的3篇文章（包括MIT的Daniel G Anderson和本文的作者Howard Y. Chang）【1-3】对于合成的circRNA是否有免疫原性得出了不同的结论。这也促使人们重新审视circRNA本身的问题。
2022年3月30日，斯坦福大学Howard Y. Chang团队在Molecular Cell上发表了Matter Arising文章Circular RNA migration in agarose gel electrophoresis，发现在不同的琼脂糖凝胶体系中circRNA迁移模式的差异。
琼脂糖凝胶电泳不仅可以分析DNA的分子量大小，也可以用来分析RNA的大小，其原理很简单，即凝胶可以看做一个筛子，带负电荷的RNA在电场的作用下会向正极移动，其移动速率与其分子量和形状以及筛子本身的特性有关。研究人员在体外合成了一个circRNA（图1A），其前体RNA为1961nt、线性对照为1523nt、circRNA为1475nt、两个剪切的内含子分别为221nt和255nt，并分别设计了6种探针进行相应的验证检测。在经过RNase R处理与否后可以看到三种RNA分子在Northern Blot中的改变以及各个RNA分子的分子量（图1B）。
图1
然而在Daniel G Anderson的工作中，他们使用的是Thermo Fisher的E-Gel EX预制天然琼脂糖凝胶，发现circRNA比分子量更大的线性前体迁移速度更慢（图2）。
图2
那么是E-Gel中的什么导致了circRNA迁移更慢呢？研究人员采用商业化的甲酰胺作为样本缓冲液（GLBII）采用和Daniel G Anderson工作中同样的方法，在2%的E-Gel EX胶中跑了13min中后，得到了与Daniel G Anderson同样的结果（图3左），即circRNA跑的最慢，前面以此是线性前体RNA、线性RNA。但把时间延长至18min，则发现circRNA与前体RNA位置重合，而起最前端的线性RNA则不受影响（图3右）。于是研究人员进一步长时程多时间点观测甲酰胺作为缓冲液在E-Gel EX中的表现，发现确实随着时间延长，circRNA所对应的marker条带逐渐变小，而非EX的E-Gel却不存在这种现象。由此看来是GLB II缓冲液导致了circRNA迁移速度改变的现象。那么具体是哪种成分呢？研究人员对GLB II缓冲液进行了逐一测试，发现EDTA导致了circRNA迁移速度加快，至于体外制备circRNA的过程中使用的到盐类、还原剂等成分均不会影响circRNA的迁移速度。
图3
随后，研究人员有对其他因素进行了逐一排查，发现在低电压条件下circRNA迁移更会接近于与之对应的marker条带，但即使在低电压条件下EDTA也会其迁移速度产生影响；而有趣的是染料SYBR-GOLD I则会抵消EDTA带来的异常，下图汇总了缓冲液中不同的组分对凝胶中RNA迁移速度的影响。
图4
上述现象说明在凝胶电泳中有很多因素都会影响到RNA条带的鉴定，尤其是分子量大小方面。那么其他的鉴定方法表现如何呢？
Northern Blot因为需要探针，所以可以特异性检测目的circRNA。但是当于E-Gel共同使用时，会出现分辨率下降的情况，而是用自制胶在低电压、乙二醛作为变性剂时会取得较好的结果。
体积排阻色谱是液相色谱的一种，可以不依赖于电泳来鉴定circRNA。在进行色谱之前加入缓冲液可以影响前体RNA的洗脱时间，但是对circRNA则没有影响。另外一点与琼脂糖凝胶不同的是，EDTA并不影响色谱的结果。
总之，在该工作中，Howard Y. Chang向我们展示了凝胶电泳中应当仔细评估circRNA迁移的真实情况，最好使用多种方法进行交叉印证。
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.03.008
制版人：十一
参考文献
1. Chen, Y.G., Kim, M.V., Chen, X., Batista, P.J., Aoyama, S., Wilusz, J.E.,Iwasaki, A., and Chang, H.Y. (2017). Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity.Mol. Cell67, 228–238.e5.
2. Chen, Y.G., Chen, R., Ahmad, S., Verma, R., Kasturi, S.P., Amaya, L., Broughton, J.P., Kim, J., Cadena, C., Pulendran, B., et al. (2019). N6-Methyladenosine Modification Controls Circular RNA Immunity.Mol. Cell76,96–109.e9.
3. Wesselhoeft, R.A., Kowalski, P.S., Parker-Hale, F.C., Huang, Y., Bisaria, N., and Anderson, D.G. (2019). RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo.Mol. Cell74, 508–520.e4.
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