巨噬细胞是人体固有免疫的第一道防线，可以通过对凋亡细胞、微生物和肿瘤细胞的吞噬和降解维持机体的平衡。当人体受到病理或机械损伤刺激时，会激活巨噬细胞产生一氧化氮（NO）和活性氧（ROS），并分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6等一系列细胞因子，从而抵御病原体入侵，保护宿主免受侵害。因此，激活巨噬细胞是宿主提高免疫能力的重要途径。

长春大学食品科学与工程学院的胡彦波、王思琪、赵 珺*等人以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为模型，研究水溶性豆渣多糖（SSPS）对RAW264.7细胞的活化作用，包括NO和ROS的释放、相关细胞因子的分泌；并进一步研究其对RAW264.7细胞活化的机制，从而评价SSPS的免疫调节作用，以期为后续豆渣的深入开发应用提供理论参考。

1、水溶性豆渣多糖的分离纯化

以豆渣为原料，按照图1所示的技术路线图制备SSPS。鉴于在分离纯化过程中，其他组分的得率和纯度较低，因此选择SSPS、SSPS-A1、SSPS-A1-c、SSPS-N和SSPS-N-b进行后续实验研究。

2、水溶性豆渣多糖组分对RAW264.7细胞NO浓度的影响

如图2所示，RAW264.7细胞经阳性对照组LPS刺激后NO浓度高度显著增加（P＜0.001）。与空白对照组相比，SSPS-N和SSPS-N-b处理后细胞NO浓度无显著变化；而SSPS、SSPS-A1和SSPS-A1-c处理细胞后NO浓度高度显著增加（P＜0.001）。

3、SSPS-A1-c对RAW264.7细胞的活化作用研究

SSPS-A1-c对RAW264.7细胞存活率的影响

如图3所示，与空白对照组相比，不同质量浓度的SSPS-A1-c对RAW264.7细胞的存活率影响不同。当质量浓度低于400 μg/mL时，SSPS-A1-c对RAW264.7细胞存活率均无显著影响（P＞0.05），说明SSPS-A1-c的质量浓度低于400 μg/mL时对细胞没有毒性。当SSPS-A1-c质量浓度为800 μg/mL时，细胞存活率呈高度显著的降低趋势（P＜0.001），说明过高质量浓度的多糖样品对细胞会产生一定的毒性，从而降低其存活率。因此，综合细胞存活率实验结果，选择质量浓度为25、50、100 μg/mL对细胞进行后续实验处理，并在此质量浓度下，评价SSPS-A1-c对RAW264.7细胞的免疫调节作用。

SSPS-A1-c对RAW264.7细胞释放NO和ROS的影响

如图4所示，RAW264.7细胞经阳性对照组LPS刺激后NO和ROS水平高度显著增加（P＜0.001）。与空白对照组相比，当使用25 µg/mL的SSPS-A1-c处理后，细胞NO浓度增加，当浓度增加到50 µg/mL和100 μg/mL，NO浓度高度显著增加（P＜0.001），在100 μg/mL时NO浓度与LPS刺激后NO浓度相当；当使用25 µg/mL的SSPS-A1-c处理后，细胞ROS水平呈现高度显著升高（P＜0.001），随着SSPS-A1-c质量浓度的增加，ROS水平明显增加并呈现剂量依赖性。上述研究结果说明SSPS-A1-c在一定质量浓度下可激活并提高巨噬细胞RAW264.7释放NO和ROS的能力。

SSPS-A1-c对RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β和IL-6质量浓度的影响

如图5所示，与空白对照组相比，阳性对照组的TNF-α、IL-1β和IL-6质量浓度高度显著增加（P＜0.001）。随着SSPS-A1-c质量浓度的增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的质量浓度也呈现高度显著增加（P＜0.001）。与空白对照组相比，当SSPS-A1-c的质量浓度为25 µg/mL时，IL-1β的分泌量没有显著变化（P＞0.05），而TNF-α和IL-6的质量浓度则呈现出明显变化；当质量浓度增加为50 µg/mL和100 µg/mL时，TNF-α、IL-1β和IL-6质量浓度均呈现出高度显著变化（P＜0.001）。说明在高质量浓度SSPS-A1-c对细胞因子的分泌具有明显的促进作用，且呈现出浓度依赖性。

综上所述，SSPS-A1-c可以促进RAW264.7细胞释放NO和ROS，分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等相关细胞因子，从而促进RAW264.7巨噬细胞的活化。

4、SSPS-A1-c对RAW264.7细胞的活化机制

MAPKs信号通路

如图6A所示，不同质量浓度的SSPS-A1-c均可以明显促进JNK、ERK和p38的磷酸化；同时其磷酸化呈现剂量依赖性，随着SSPS-A1-c质量浓度的增加，磷酸化程度（p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和p-p38/p-38的相对表达量）明显升高，当质量浓度达到100 µg/mL时，磷酸化的程度最大，JNK、ERK和p38的磷酸化程度分别为空白对照组的9.5、5.2 倍和2.0 倍。说明SSPS-A1-c可以通过促进JNK、ERK和p38的磷酸化活化巨噬细胞。进一步使用JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB203580预处理RAW264.7细胞，然后与SSPS-A1-c共处理，测定相关蛋白的表达量。

从Western blot和蛋白表达量的相对灰度分析结果中可以看出（图6B），当加入JNK、ERK和p38的抑制剂后，可以明显降低蛋白的表达；此外，不同抑制剂（SP600125、U0126、SB203580）与SSPS-A1-c共处理24 h后NO的浓度以及TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（图6C）。这些结果均表明SSPS-A1-c通过MAPKs通路激活巨噬细胞。

NF-κB信号通路

如图7A1所示，随着SSPS-A1-c质量浓度的增加，IκB-α的降解程度逐渐增加，当使用100 μg/mL SSPS-A1-c处理30 min后，仅有26.8%的IκB-α未降解，大部分的IκB-α发生了降解。为进一步研究NF-κB信号通路在SSPS-A1-c诱导的RAW264.7巨噬细胞活化中的作用，采用BAY-117082预处理巨噬细胞，然后与SSPS-A1-c共处理，从Western blot蛋白表达量的相对灰度分析结果中可以看出（图7A2），IκB-α的降解程度明显下降；此外，NO的浓度以及TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低（图7B）。这些结果均表明SSPS-A1-c通过NF-κB信号通路促进巨噬细胞的活化。

结 论

本实验主要研究了SSPS的免疫调节作用，明确其发挥功能的主要级分为水溶性豆渣酸性多糖SSPS-A1-c。进一步研究了SSPS-A1-c对RAW264.7细胞的活化作用及其机制，结果表明，SSPS-A1-c可以促进RAW264.7细胞释放NO和ROS，同时促进TNF-α、IL-1β和IL-6等免疫调节因子的分泌，并呈现剂量依赖性；SSPS-A1-c可以促进MAPKs相关蛋白JNK、ERK和p38磷酸化，同时促进NF-κB信号通路中IκB-α的降解，说明其作用机制与MAPKs和NF-κB信号通路相关。综上所述，水溶性豆渣酸性多糖对RAW264.7细胞具有较好的免疫调节作用，该研究成果将为豆渣多糖的综合开发利用提供新的思路，同时为食品功能性因子开发提供参考。

本文《水溶性豆渣酸性多糖对RAW264.7细胞的免疫调节作用及其机制》来源于《食品科学》2022年43卷3期169-177页，作者：胡彦波，王思琪，石曾卉，翟丽媛，赵珺。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210429-416。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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