胰腺癌主要由胰腺导管腺癌 (PDAC) 组成，是最致命的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一，其 5 年生存率低至 9%。先天免疫在胰腺导管腺癌 (PDAC) 作为非 T 细胞富集的肿瘤中起重要作用。中性粒细胞是先天免疫系统的主要参与者。在这里，该研究旨在探索 PDAC 中中性粒细胞的异质性和促肿瘤机制。

2022年6月10日，上海交通大学沈柏用，陈赛娟及蒋玲曦共同通讯在Gut（IF=23）在线发表题为“Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment ”的研究论文，该研究分析了来自 5 名 PDAC 患者的外周血多形核白细胞 (PMN) 和肿瘤浸润免疫细胞的单细胞转录组，并进行了免疫荧光/免疫组织化学染色、多组学分析和体外实验，以验证生物信息学分析的发现。对肿瘤相关中性粒细胞 (TAN) 异质性的探索揭示了与预后不良相关的终末分化前肿瘤亚群 (TAN-1)、炎症亚群 (TAN-2)、刚刚迁移至肿瘤微环境（TAN-3）和优先表达干扰素刺激基因（TAN-4）的亚群。糖酵解特征沿中性粒细胞转换轨迹上调，TAN-1 具有过度活化的糖酵解活性。

通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析的综合多组学方法验证了 TAN 的糖酵解转换。通过 LDHA 过表达激活糖酵解活性诱导中性粒细胞样分化的 HL-60 (dHL-60) 细胞的免疫抑制和促肿瘤功能。机制研究表明，在缺氧和内质网应激的下游，BHLHE40 是中性粒细胞向 TAN-1 表型极化的关键调节因子，染色质免疫沉淀试验证明了 BHLHE40 对 TAN-1 标记基因的直接转录调控。在过表达 BHLHE40 的 dHL-60 细胞中观察到促肿瘤和免疫抑制功能。重要的是，PDAC 组织的免疫组织化学分析揭示了 BHLHE40+ 中性粒细胞的不利预后价值。总之，该研究揭示的 TANs 的动态特性将有助于推进针对先天免疫的 PDAC 治疗。

胰腺癌主要由胰腺导管腺癌 (PDAC) 组成，是最致命的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一，其 5 年生存率低至 9%。具有免疫检查点阻断或嵌合抗原受体 T 的免疫治疗策略在 PDAC 中的疗效有限，因为高基质密度对 T 细胞浸润形成了物理屏障。在 PDAC 的免疫环境中观察到最小的抗肿瘤 T 细胞浸润。在非 T 细胞浸润性肿瘤中，需要触发先天免疫激活，从而促进效应 T 细胞运输的信号并桥接获得性免疫。因此，针对先天免疫系统的治疗干预可能为 PDAC 中当前的免疫疗法提供替代选择。

与其他实体瘤相似，PDAC 的特点是免疫抑制细胞在肿瘤微环境中广泛浸润。癌细胞培养纤维炎症滤液以提供有利的微环境，支持肿瘤细胞的免疫逃逸、恶性转化和进展。在各种类型的肿瘤浸润免疫细胞中，中性粒细胞在肿瘤进展中的重要作用在过去十年中引起了广泛的研究兴趣。中性粒细胞是一种高度可塑性的群体，在响应各种环境线索时呈现出异质表型。

N2极化中性粒细胞代表了肿瘤微环境中的绝大多数中性粒细胞，通过促进肿瘤细胞增殖、血管生成、组织重塑、免疫抑制和转移来支持肿瘤进展。肿瘤相关中性粒细胞 (TAN) 的浸润已被认为是大多数实体恶性肿瘤的不利预后因素。然而，仍有证据表明中性粒细胞会对抗肿瘤进展，因为它们表现出对肿瘤细胞的直接细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性。因此，肿瘤中 TAN 的表征仍然不清楚。

在之前的一项研究中，来自 TCGA 队列的大量 RNA 测序 (RNA-seq) 数据的生物信息学分析表明，与其他癌症类型相比，PDAC 中的 TAN 浸润相对丰富，这表明 TAN 在 PDAC 微环境中的重要性。然而，大多数使用单细胞测序方法的先前研究未能从 PDAC 组织中检测到人类中性粒细胞。

研究人员假设这是由于中性粒细胞的性质导致的系统偏差，因为中性粒细胞是寿命短的脆弱细胞。中性粒细胞衍生颗粒中的高敏感性和各种酶有助于它们在体外的脆弱性。因此，中性粒细胞可能无法在组织消化或单细胞捕获过程中存活下来。使用 BD Rhapsody 的基于微孔的单细胞捕获方法为表征人类中性粒细胞提供了另一种选择。

文章模式图（图源自Gut ）

在这项研究中，使用 BD Rhapsody 成功地从 5 名 PDAC 患者中获得了 21 972 个中性粒细胞的单细胞转录组。该研究探索了 PDAC 微环境中 TANs 的异质性，并通过对 PDAC 组织的免疫荧光 (IF) 和免疫组织化学 (IHC) 染色进一步验证了新发现的中性粒细胞亚型的存在和临床相关性。此外，该研究揭示了推动 TAN 向促进肿瘤表型发展的潜在机制，并确定了与中性粒细胞相关的潜在治疗靶点。

对肿瘤相关中性粒细胞 (TAN) 异质性的探索揭示了与预后不良相关的终末分化前肿瘤亚群 (TAN-1)、炎症亚群 (TAN-2)、刚刚迁移至肿瘤微环境（TAN-3）和优先表达干扰素刺激基因（TAN-4）的亚群。糖酵解特征沿中性粒细胞转换轨迹上调，TAN-1 具有过度活化的糖酵解活性。

通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析的综合多组学方法验证了 TAN 的糖酵解转换。通过 LDHA 过表达激活糖酵解活性诱导中性粒细胞样分化的 HL-60 (dHL-60) 细胞的免疫抑制和促肿瘤功能。机制研究表明，在缺氧和内质网应激的下游，BHLHE40 是中性粒细胞向 TAN-1 表型极化的关键调节因子，染色质免疫沉淀试验证明了 BHLHE40 对 TAN-1 标记基因的直接转录调控。在过表达 BHLHE40 的 dHL-60 细胞中观察到促肿瘤和免疫抑制功能。重要的是，PDAC 组织的免疫组织化学分析揭示了 BHLHE40+ 中性粒细胞的不利预后价值。总之，该研究揭示的 TANs 的动态特性将有助于推进针对先天免疫的 PDAC 治疗。

参考消息：

https://gut.bmj.com/content/early/2022/06/09/gutjnl-2021-326070