具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，Fn）是革兰氏阴性厌氧菌，拟杆菌科，梭杆菌属，为人类共生菌。人类口腔、胃肠道等部位均发现其存在，该菌在不同的生态位下其种属有一定的特异性，属条件致病菌。已有研究发现，具核梭杆菌与牙周疾病直接相关，其在口腔菌斑生物膜的形成中起到重要连接作用，且可协同其他口腔致病菌产生内毒素及刺激因子，诱导炎症发生。

苯乳酸作为天然有机酸，可以由部分乳酸菌通过苯丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下产生或由非乳酸菌如白地霉等产生，其结构稳定，可耐受高温等不良条件，为天然、安全的抗菌剂，能够有效抑制细菌、真菌的生长。鉴于Fn对于结肠癌等恶性肿瘤细胞的保护及促生长和转移的特性，以及其可能于肠道形成生物膜对健康造成的威胁，东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室的孔祥丽、马岩石、许晓曦*等探究苯乳酸对Fn的生长抑制和破坏其形成生物膜的能力，在苯乳酸抑菌方面有重要的现实意义和实际应用价值。

1、Fn生长稳定期的确定

如图1所示，经培养6 h后，Fn可达到生长对数期，当培养时间为27 h，菌株达到生长稳定期，因此Fn的最佳生长周期为27 h。在27 h前后选取一个时间点作为后续研究的统一判定时间，即选取24 h和48 h作为判断苯乳酸抑菌效果的时间点，测定苯乳酸对Fn生长的影响。

2、苯乳酸对Fn的抑制效果

如图2A所示，随苯乳酸质量浓度的增加，Fn的生长速率减慢。在24 h厌氧培养期间，0.4 mg/mL苯乳酸即导致Fn的生长速率明显降低，0.7 mg/mL苯乳酸对Fn达到完全抑制，且0.7 mg/mL苯乳酸处理2 h就产生了抑制效果。

如图2B所示，0.4 mg/mL苯乳酸处理0 h和24 h的OD600 nm差异较小，苯乳酸质量浓度大于0.4 mg/mL即可在短时间内完全抑制Fn生长。加入0.5 mg/mL苯乳酸厌氧培养24 h和48 h后OD600 nm差异不明显。因此，苯乳酸对Fn的MIC为0.5 mg/mL。将质量浓度0.5 mg/mL苯乳酸处理48 h后的Fn菌液涂在血平板上，厌氧培养72 h时的菌落计数结果为3.5×103 CFU/mL，而质量浓度大于或等于0.7 mg/mL的苯乳酸处理组无活菌检出，此结果与图2A结果一致。因此，苯乳酸对Fn的MBC为0.7 mg/mL。

3、苯乳酸对Fn形态的影响

从图3A可看出，空白对照组的Fn两端为梭状，表面光滑。加入1/2 MIC苯乳酸处理后，Fn表面有少量蛋白溶出现象，部分菌体抱团、黏连，菌体表面变得粗糙和部分溶解，表面变得不光滑（图3B）。经MIC苯乳酸处理后，Fn细胞壁可能受损，细菌形态变得纤细，且表面产生大量凸起（图3C），推测为胞内物质渗出。经2 MIC苯乳酸处理后，Fn已无法维持正常菌体形态，表面粗糙不平，细胞膜和细胞壁严重损坏（图3D）。由此可推测苯乳酸破坏了细胞膜结构，导致内容物泄漏。

4、苯乳酸处理对Fn上清液中蛋白含量、氧化还原电位和pH值的影响

由图4A可知，与空白对照组相比，0.2、0.4 mg/mL苯乳酸处理组上清液中蛋白含量均显著增加（P＜0.05）。而在更高质量浓度的苯乳酸作用下，与0.4 mg/mL组相比，上清液中蛋白含量显著减少（P＜0.05），其原因可能是随苯乳酸质量浓度增加，溶液酸度升高，0.4 mg/mL苯乳酸处理组pH值为5.43±0.01，0.8 mg/mL苯乳酸处理组pH值则为4.50±0.01（图4B），已低于蛋白质的等电点，由于酸的作用，上清液中的蛋白质发生沉降而含量降低。随着苯乳酸的质量浓度增加，上清液的ORP总体呈增加趋势，即氧化性增强，培养基中杂质减少，进一步证明上清液蛋白质发生了沉降。

5、苯乳酸对Fn细胞膜完整性的影响

空白对照组的Fn中有少量凋亡，经PI荧光探针染色后，仅出现少许红色荧光（图5A），1/2 MIC苯乳酸处理Fn 2 h后，红色荧光强度有所增加（图5B），即细胞的通透性增加；MIC苯乳酸处理Fn时，细胞膜损伤程度进一步增加，红色荧光强度明显增多，在整个检测范围内产生均匀的光斑（图5C）。同时，将经过CTMAB处理细胞膜的荧光状态作为阳性对照组（图5D），与阳性对照组相比，1/2 MIC苯乳酸处理的Fn细胞膜受损程度较小，而MIC苯乳酸处理的细胞膜损伤程度与之接近。

如图6所示，空白对照组的Fn荧光阳性率为3.6%（图6A），为细菌正常代谢凋亡比例，1/2 MIC苯乳酸处理后细胞的荧光阳性率达到10.9%（图6B），MIC苯乳酸处理后的Fn的荧光阳性率达到51.6%（图6C），而阳性对照组的荧光阳性率为45.9%（图6D），该结果与全自动荧光免疫分析仪结果（图5）一致。综上所述，苯乳酸破坏了Fn细胞膜的选择透过性及完整性，细胞膜通透性提高。

6、苯乳酸对Fn胞内蛋白的影响

如图7所示，与空白对照组相比，经过0.2、0.4 mg/mL的苯乳酸处理后Fn中分子质量为130 kDa以上的蛋白数量减少，70 kDa左右蛋白含量增多，说明苯乳酸影响了Fn的代谢过程，改变了蛋白合成途径。0.8 mg/mL的苯乳酸使其胞内蛋白含量减少，这与之前发现的蛋白质外泄结果相一致，由于细胞膜破损严重，相对较大的蛋白分子也流出，导致细菌活性减弱，合成蛋白能力降低，蛋白含量减少。

7、苯乳酸对Fn形成生物膜的影响

如图8A所示，经过48 h培养，空白对照组中大量Fn形成致密的生物膜，黏附在培养玻璃片（φ=8 mm）表面，Fn尖端相连，并有所缠绕，PBS清洗不易脱落；但经MIC苯乳酸处理2 h后，视野内Fn数量明显减少，且生物膜暴露出不规则孔洞，致密程度下降，菌体连接较松散，由空白对照中的缠绕形态转变为菌体之间的黏连（图8B），其胞外物质表观结构出现不规则空隙，表明苯乳酸破坏了该生物膜结构。由此可知，苯乳酸能抑制Fn的生长，进而抑制生物膜的形成，并且能使原有的生物膜脱落和破损，说明苯乳酸对Fn形成的生物膜有良好的消杀作用。

如表1所示，与空白对照组相比，0.5 mg/mL苯乳酸处理组的生物膜含量显著降低（P＜0.05）。相同质量浓度苯乳酸和乳酸处理对Fn生物膜的破坏性差异明显，0.5 mg/mL乳酸处理组的生物膜含量与空白对照组相比无显著差异（P＞0.05）。0.5 mg/mL乳酸组的pH值远低于0.5 mg/mL苯乳酸组，说明苯乳酸对生物膜的破坏性来自于其本身的结构，而非由其酸性导致的。

结 论

苯乳酸对Fn具有良好的抑菌能力，其抑菌机制为改变细菌细胞膜的通透性，使胞内蛋白外泄；且苯乳酸降低了Fn的黏附性，对其生物膜亦具有破坏作用。因此，未来可将苯乳酸应用于调控肠道微生态及预防肠道病原菌生物膜引发疾病的功能性食品。

通信作者简介

许晓曦，东北农业大学食品学院畜产品加工系教授，博士研究生导师。现为教育部乳品重点实验室骨干教师，黑龙江省教育厅科技创新团队骨干、东北农业大学乳品科技创新团队和新型肉制品加工创新团队骨干。中国食品药品监督管理局保健食品审评中心特殊医学食品审评专家、哈尔滨市奶业协会乳品加工分会副主席、中国认证机构国家认可委员会乳业技术专家等。

1993年毕业后从教至今，一直从事畜产品加工和食品安全方向的教学和科研工作，主讲《乳品安全与质量控制》、《液态乳品科学与技术》等多门课程。发表文章100余篇，主编和参加编写的专业教材6部以及参编中国农业出版社出版的《中国奶业史》及《奶业科普百问》、《动动奶酪又何妨》2部农业部科普类专业书籍，申请专利14项、获得授权专利2项及实用新型专利10项。主持/参加多项国家科技攻关、“十一五”、“十二五”科技支撑项目和省重大专项（子课题）等，并主持多项企业横向研究课题。多项研究成果获得省、市及国家级奖励。

第一作者简介

孔祥丽，硕士研究生，东北农业大学食品学院。2019.7毕业于东北农业大学食品学院乳品工程专业，目前就读畜产品加工工程专业，研究方向为乳品科学与技术、乳品安全与质量管理。研究生期间，参与黑龙江省“百千万”工程科技重大专项项目《乳制品与肉类加工科技重大专项》等，作为第一作者在国内核心期刊发表论文2篇，参与发表SCI论文1篇，核心期刊论文4篇。

本文《苯乳酸对具核梭杆菌的抑菌效果及机制》来源于《食品科学》2022年43卷7期38-44页，作者：孔祥丽，马岩石，吴昕雨，许晓曦。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210401-016。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

作者介绍由本文作者提供；图片来源于文章原文及百度图片。