对哺乳动物的大脑神经元、神经胶质和微血管系统的非侵入性活体可视化研究，有利于增强我们对大脑功能的理解，对于研究神经科学和生物体中的许多现象至关重要。

目前，为小鼠的大脑成像主要手段是利用开颅以及薄颅窗口提供光学窗口。开颅窗口这种具有侵入性的方式，会引发炎症反应并扰乱神经元；而薄颅窗口，将颅骨磨薄，尽管可以有效减少光学散射并保持头骨结构完整性，但其仍然存在光学异质性，产生相差，导致空间分辨率的严重下降。这使得以微创方式解析深层皮质和皮质下层的亚细胞结构的体内多光子成像成为一大难题。

基于这些挑战，香港科技大学瞿佳男教授课题组搭建了一个结合三光子激发和自适应光学的新型显微技术平台，实现在 1,300 nm 激发波长下，对小鼠皮层中的精细神经元结构进行高分辨率的经颅活体脑成像。使用这一技术，能够指导精确的激光介导显微手术，同时用于灵敏准确的功能性钙成像。相关成果以“Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping”发表于Nature Biotechnology。

AO-3PM 系统

在双光子激发荧光显微镜中，通过对样品在双光子激发后发出的荧光进行探测，可以以非侵入性方式对活体组织进行多维度成像。但对于更深处的组织，由于光子传播距离增加，因散射而导致丢失的可能性也随之增大。其中一种解决方法是增加激发光子的波长，使得荧光基团吸收足够多的辐射能量。

而三光子激发荧光显微镜(3PM) ，使用长激发波长和以及高阶非线性激发的光学成像技术，减少了散射和不需要的背景荧光，与双光子相比，可在大脑深处获得更清晰的图像，在体内成像哺乳动物大脑方面显示出巨大的潜力。

然而，3PM 仍然会因生物组织中的折射率变化而产生像差，从而严重降低空间分辨率。自适应光学 (AO) 是一种光学技术，通过矫正光学系统或生物样本带来的像差来改善成像。这项工作中引入α-FSS方法，首先利用一种高频调制和相敏检测方案，以快速、高光子效率的方式，实现电场点扩散函数的准确测量，通过使用高像素计数波前校正器，可以对大量模态进行后续的像差校正。此外，将远程聚焦方法与共轭 AO 配置相结合，实现对大体积成像的有效单次校正，以便透过混浊层（即完整颅骨）成像。

图一、AO-3PM 系统装置简化示意图

经颅活体脑成像

研究人员使用 1,300 nm 的波长验证了该AO-3PM 系统的体内和体外成像性能。通过完整颅骨，对小鼠皮质进行体内结构和功能成像，获得了软脑膜下方高达 750 µm 的高分辨率图像。同时，在完整大脑的结构成像中，实现了深至内软脑膜下方 1.1 毫米处的皮质下结构高分辨率成像。与传统的 3PM 相比，该 AO-3PM 在更深处实现了更高的空间分辨率和荧光信号。利用 α-FSS 提供的紧密对焦，研究进一步展示了以该系统为指导的精确激光显微外科手术，并透过完整的颅骨研究了皮质中的术后小胶质细胞动力学。

图二、 大体积高分辨率经颅活体脑成像

小结：此项工作搭建了一种AO-3PM光学系统，展示了该系统在 1,300 nm 激发波长下的脑深部成像能力，能有效矫正颅骨和脑组织引起的像差，并使用该系统来指导精确的激光介导显微外科手术以及准确灵敏的功能性钙成像。AO-3PM 技术在推进体内成像技术和促进活体大脑研究方面将具有巨大潜力。

瞿佳男教授（右三）和叶玉如教授（左三）

全文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01343-w

来源：高分子科学前沿

声明：仅代表作者个人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下方留言指正！