宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）是管状花目茄科枸杞属植物，其果实被称为枸杞子，又名枸杞豆、枸杞子等，是药食同源的植物资源。枸杞果实中含有多种丰富的活性成分，具有降血糖、抗氧化、增强免疫力等作用。由于枸杞本身并无特别突出的香味，以枸杞为原料生产的枸杞原浆风味欠佳，严重地影响了枸杞类饮品的生产和开发。
宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室的胡明珍、刘慧燕、方海田*等以宁夏枸杞为原料，采用从传统发酵浆水中分离出的1 株乳酸菌进行枸杞汁液态发酵，研究发酵液中代谢产物的变化。采用气相色谱-质谱（GC-MS）非靶向代谢组学方法研究不同阶段枸杞发酵液中的代谢组分，结合多元统计分析方法筛选差异代谢物，分析相关的代谢通路，旨在为植物发酵过程中化学物质表征和功能成分研究提供有效研究策略。
1、不同阶段枸杞发酵液代谢物PCA
如图1所示，4 组发酵液样品以及质控样品样本组的平行样本聚在一起，表明所有检测具有良好的分析稳定性和实验重现性；同时，PC1和PC2贡献率分别为53.80%和19.60%，两者累计贡献率达到73.40%，可见各时间内枸杞发酵液之间分离趋势较明显，从整体上反映出这些样品之间的代谢物差异。
2、不同阶段枸杞发酵液代谢物PLS-DA
进一步采用PLS-DA对构建的模型进行验证，4个时间点内枸杞发酵液样本PLS-DA得分图和置换检验结果如图2所示，其结果与PCA相似，正离子模式下所建模型对发酵液的累计判别解释能力R2X=0.884，R2Y=0.985，对模型预测能力Q2=0.949，这3个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，模型的拟合度较好。
同时采用n=200的随机置换检验（图3），可见模型随着置换保留度下降，R2和Q2下降，回归线呈向上的趋势，且位于最右边的R2和Q2值均超过0.9，Q2回归线的截距为-1.007 9，说明置换检验过关，模型不存在过拟合现象，具有很好的稳定性和预测性，适合探索接种乳酸菌后枸杞汁发酵过程中的代谢物差异。
3、差异代谢物的筛选与分析
结果如表1（点击下方阅读原文即可查看）所示，从4个阶段的枸杞发酵液中共筛选出14 大类63种差异代谢物，差异代谢物的种类由多到少为有机酸及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物、羧酸及其衍生物、脂肪酰基、类黄酮、呋喃、咪唑嘧啶、吲哚及其衍生物、非金属氧阴离子化合物、酚酸类、三萜类、吡啶及其衍生物等。
4、差异代谢物的聚类分析
如图4所示，根据上方样本聚类的树状图，可以分成两个区域，发酵22 h的6个平行样本为第1区域，未发酵、发酵0 h和发酵10 h为第2区域，可见发酵22 h后的代谢物颜色比其他3个阶段深，而这3 组中发酵10 h后的代谢物丰度又远超过其他两组，可见两个样本分支离的越近，说明这两个样本所有代谢物的表达模式越接近，即代谢物表达量变化趋势越接近。从最左图中可以看出发酵组（FGJF_22h）高含量差异代谢物超过50%，明显多于对照组（UFGJ2），其中发酵组中的有机酸及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物含量均高于未发酵组，其他类代谢物在两组中的含量差别不明显。同时，在鉴定出的63种差异性代谢物中，烟酸、肌氨酸在发酵22 h后表达量低于未发酵的枸杞汁。
5、差异代谢物的代谢通路分析
将上述筛选鉴定的差异代谢物匹配信息后，利用对应物种的通路数据库对其进行富集分析和拓扑结构分析，根据代谢通路的浓缩，识别出可能的受生物扰动的代谢通路。首先，对差异代谢物和通路进行相关性分析，得到多条相关代谢通路。再根据P值和Impact值综合分析，筛选出最为显著的具体关键代谢通路有9 条，结果如表2所示。
针对枸杞益生菌发酵过程中差异组分进行KEGG富集分析，分析发酵阶段对益生菌发酵枸杞过程中代谢通路分析的影响，结果以气泡图的形式展现（图5）。气泡代表KEGG代谢通路，气泡所在横坐标和气泡大小表示影响值，气泡越大，表示通路重要性越大；纵坐标和气泡颜色表示富集分析的P值（取负常用对数，即-lgP），颜色越深P值越小，富集程度越显著。由图5可知，既有合成途径也有降解途径，其中丙氨酸代谢处的气泡颜色最深、气泡相对较大，说明随着发酵时间的延长，对乳酸菌发酵枸杞代谢中氨基酸类物质的影响最显著。
其次，通过KEGG等权威代谢物数据库对差异代谢物进行映射，反映出具有极显著差异的物质有10个，分别为丙氨酸、柠檬烯、苯甲醛、苯甲酸、烟酰胺、烟酸、角鲨烯、脯氨酸、肌氨酸、2-苯基乙酰胺。为了更直观地了解关键代谢物，使用箱形图比较来自4个不同阶段枸杞发酵液中这10种物质的含量丰度差异（图6）。
结 论
基于GC-MS的非靶向代谢组学技术，从未发酵、接菌发酵0 h、接菌发酵10 h和接菌发酵22 h的4种枸杞发酵液中鉴定分析出63种差异代谢产物。通过对差异代谢物和通路进行相关性分析，筛选出了9 条最为显著的关键代谢通路，映射出丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、2-苯基乙酰胺、柠檬烯、苯甲醛、苯甲酸、烟酰胺、烟酸、角鲨烯为关键代谢物。枸杞发酵液的差异代谢物中参与脂肪代谢途径的有1种，参与辅助因子和维生素的代谢的有2种，参与外源生物降解和代谢的2种，而有参与氨基酸代谢的有3种，可见不同发酵阶段可以调节枸杞中氨基酸类物质的代谢，显著影响枸杞发酵产品特殊风味物质的形成。并且发现了具有增强机体免疫能力、抗衰老、抗肿瘤等多种生理功能的活性物质角鲨烯。该模型的建立可以有效对发酵过程中氨基酸、有机酸、糖类等生物活性物质含量变化进行区分，有助于探究外源添加物对枸杞的增效作用。同时为不同阶段益生菌发酵产品建立了有效的评价方法，也为开发富含活菌和多种活性成分的枸杞发酵产品提供一定的理论参考。
本文《基于非靶向代谢组学分析副干酪乳杆菌发酵枸杞汁各阶段代谢差异》来源于《食品科学》2022年43卷8期142-149页，作者：胡明珍，刘慧燕，潘琳，王彤，李旭阳，王艳萍，方海田。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210316-214。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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