Introduction

水包油（O/W）型乳液在食品体系中普遍存在，然而大多数O/W乳液在反复冻融后会产生物理不稳定现象，如乳析或相分离等。因此，具有良好冻融稳定性的乳液体系对冷冻食品有着重要意义。在冷冻过程中，冰晶的形成会迫使乳滴聚集在一起，促进液滴-液滴相互作用；冰晶还可能穿透乳滴，破坏乳液的界面层，使解冻后的乳滴融合，导致更大程度的聚结。

与其他乳化剂稳定的乳液一样，蛋白质稳定的乳液在冻融处理后也常出现不稳定现象。为了解决这一问题，人们提出了一些策略。例如通过蛋白质的热诱导处理来提高乳液的冻融稳定性，也有研究者通过改性蛋白质来提高乳液的冻融稳定。此外，还有报道通过在水相中添加盐离子来改善蛋白质稳定乳液的冻融稳定性。目前普遍认为在水相中添加盐离子是提高蛋白质稳定乳液冻融稳定性的有效途径。然而从健康的角度来看，降低食品中盐的添加量一直是食品科学家和企业追求的目标。在尽可能减少盐的添加量的前提下，乳液是否能表现出良好的冻融稳定性值得关注。因此，华中农业大学的来昊、李斌、李晶*等通过减小初始乳液粒径和添加低离子强度的盐相结合的方式，以期获得经三次冻融循环处理仍然具有良好稳定性的乳清分离蛋白（WPI）稳定的乳液。

Results and Discussion

为了研究乳液粒径对乳液冻融稳定性的影响，制备了粒径（d4,3）为8.92、1.28、0.83和0.65 μm的初始乳液（分别记为EuA、EuB、EuC和EuD）。对乳液进行冻融循环处理，发现冻融处理导致所有乳液都出现了不同程度的失稳现象（图1），乳液的破乳程度随着初始乳液粒径的减小而降低；随着冻融次数的增加，乳液的破乳程度增大。

图1乳液在冻融前后的外观（A）、粒径（B）和光学显微图像（C）

即使是初始粒径最小的EuD，在三次冻融循环后也发生了轻微的析油现象。为了进一步提高乳液的冻融稳定性，在WPI中添加了低离子强度的盐，将不同离子强度的NaCl加入到WPI分散液（4%, m/V）中，用与EuC相同的制备方法制备不同离子强度（10-70 mmol/L NaCl）的乳液，分别标记为EuC-10、EuC-30、EuC-50和EuC-70。

对乳液进行冻融循环处理，结果发现在第二次冻融处理后，除EuC-10外其他乳液相对稳定；随着冻融次数的增加，EuC-10出现了严重的析油现象，EuC-70出现了轻微的乳析现象，而EuC-30和EuC-50则未观察到明显的失稳现象（图2A）。三次冻融处理后，显微视野中所有乳滴的尺寸都增大了，在EuC-70的视野中能观察到大量的块状聚集体，而在EuC-30或EuC-50中聚集体较少（图2B）。

图2 添加NaCl (10-70 mmol/L)的乳液在冻融前后的外观（A）和光学显微图像（B）

粒径和ζ-电位的结果表明（图3），随着冻融次数的增加，乳液的粒径逐渐增大。在相同的冻融次数下，随着离子强度的增加，乳液的粒径逐渐增大，并且分散在SDS溶液中测得的乳液粒径与分散在去离子水中测得的乳粒径差值增大，表明在冻融过程中离子强度的增加导致乳滴主要发生的是絮凝而不是聚结。随着离子强度的增加，初始乳液的ζ-电位显著降低，表明盐的加入产生了静电屏蔽效应。冻融处理对乳液的ζ-电位影响不大。

图3 以水为分散相测得的乳液粒径（d4,3）（A），和比较以分散在水和SDS溶液中测得的乳液粒径（B），以及冻融前后乳液的ζ-电位（C）

乳液的流变学特性的测试结果表明（图4），乳液的表观黏度随着剪切速率的增加而降低，乳液呈现出剪切稀化行为。所有乳液的弹性模量（G'）均大于黏性模量（G''），表明在乳液体系中形成了以弹性为主的凝胶网络结构；并且G'和G''都随着离子强度的增加而增大，这可能是界面蛋白相互作用增强的结果。盐（NaCl）的加入通过静电屏蔽效应降低了乳滴的静电相互作用，导致乳液产生絮凝现象，乳滴之间适度的絮凝有利于乳液体系凝胶网络结构的形成，从而抑制冻融过程中乳滴的移动，提高乳液的冻融稳定性。

图4乳液的表观黏度（A）、黏弹模量（B）以及在频率为1 Hz时的G'和G''值（C）

通常来讲，蛋白质在油水界面的动态吸附行为主要由扩散、渗透和重排组成。动态吸附的结果表明（图5），盐的加入促进了WPI快速向油水界面吸附，并且WPI在界面上的扩散速率（Kdiff）随离子强度的增加而增大，这可能与蛋白质的表面活性增加有关。加入50 mmol/L NaCl后，初始乳液的粒径由0.83 μm增加到2.91 μm，AP增加了约30%，在相同的乳化条件下，初始乳液粒径的增大可能是界面强度增加的结果。

图5动态吸附曲线（A），渗透和重排曲线（B）以及界面吸附蛋白（AP）（C）

对蛋白质的理化性质进行表征（图6），结果表明随着离子强度的增加，WPI的ζ-电位逐渐降低，蛋白质表面更多的负电荷被中和，这可能会加速界面蛋白的聚集。同时，WPI的粒径随着离子强度的增加而减小，由于离子效应，蛋白质表面的疏水基团会部分折叠到分子内部，导致蛋白质分子形成更紧密的结构。WPI的表面疏水性随离子强度的增加而降低，这表明随着表面非极性基团的减少，WPI的亲水性变得更强，因此与蛋白质结合的结构水分子的数量会显著增加，这也与蛋白质溶解度的结果一致。离子强度在30-50 mmol/L时能促进WPI的溶解，界面蛋白的吸附浓度会随着蛋白质溶解度的增加而增大，这有利于提高界面强度和界面稳定性。

图6 WPI的粒径和ζ-电位（A）、溶解度和表面疏水性（B）

Conclusion

减小初始乳液的粒径可以通过延缓油滴之间的聚结来提高乳液的冻融稳定性。在乳化前向WPI水分散体 (4%, m/V) 中添加NaCl会改变蛋白质的结构和特性。具有较小粒径和较低表面电荷的蛋白质可以加速它们在油水界面处的聚集并促进更紧密的界面堆积。蛋白质表面疏水性的降低提高了它们在水中的溶解度，这有利于提高蛋白质的界面浓度。因此，当蛋白质吸附到油水界面时，通过增强界面层的刚度和厚度，有利于提高乳液的界面稳定性，从而有效地抵抗冻融过程中冰晶对乳液液滴的刺穿。NaCl的加入促进了乳液液滴间更强烈的絮凝，从而在乳液体系中形成以弹性为主的凝胶状网络结构，可以有效地抑制液滴的运动，最终提高乳液的冻融稳定性。具有较小粒径的乳液可以在较低的离子强度（30-50 mmol/L NaCl）下拥有较好的冻融稳定性。

第一作者简介

来昊，男，工学硕士，研究生毕业于华中农业大学食品科学专业，主要研究方向为胶体物性学，学位论文获2020-2021年度华中农业大学研究生优秀学位论文奖。

通信作者简介

李晶，男，博士，教授，2014年在华中农业大学获食品科学专业博士学位，现就职于华中农业大学食品科学技术学院，长期从事胶体物性和营养学的基础和应用研究。作为负责人承担包括国家自然科学基金面上项目和青年科学基金项目在内的多项纵向和横向课题；参与承担国家重点研发计划、湖北省自然科学基金创新群体项目、湖北省技术创新专项（重大项目）等多项科研项目。以第一和通讯作者发表论文30余篇；申请发明专利10余项，获授权6项；曾获湖北省科技进步一等奖、教育部自然科学二等奖、湖北省自然科学二等奖、华中农业大学教学质量优秀三等奖、华中农业大学青年教师讲课竞赛优胜奖等。入选国家高层次人才特殊支持计划青年拔尖人才，湖北省“三区”科技人员专项计划，湖北省科技特派员团队和华中农业大学狮山硕彦计划。

Influence of particle size and ionic strength on the freeze-thaw stability of emulsions stabilized by whey protein isolate

Hao Laia,b, Fuchao Zhana,b, Yujie Weia,b, Abel W.S. Zongoa,b, Sha Jianga,b, Haomin Suia,b, Bin Lia,b, Jing Lia,b,*

a College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

b Key Laboratory of Environment Correlative Dietology (Huazhong Agricultural University), Ministry of Education, Wuhan 430070, China

*Corresponding authors.

E-mail address: lijingfood@mail.hzau.edu.cn

Abstract

The influence of particle size and ionic strength on the freeze-thaw (FT) stability of emulsions stabilized by whey protein isolate (WPI) was investigated in this study. The destabilization of emulsions during the FT process could be suppressed in a way by decreasing the particle size of the initial emulsions, which was the result of retarding the coalescence between oil droplets. To further improve the FT stability of emulsions, different amounts of NaCl were added before emulsification. The emulsions with the ionic strength at 30–50 mmol/L exhibited good FT stability. Notably, the ionic strength in this range would not lower the freezing point of emulsions below the freezing temperature used in this study. Salt addition could improve the structural properties of proteins, which was available to strengthen the rigidity and thickness of interfacial layers, sequentially building up the resistance that the destruction of ice crystals to emulsions. Moreover, stronger flocculation between emulsion droplets could promote the formation of a gel-like network structure dominated by elasticity in the emulsion system, which might effectively inhibit the movement of droplets, and improve the FT stability of emulsions eventually. The result was of great significance for the preparation of emulsion-based foods with improved FT stability.

Reference:

LAI H, ZHAN F C, WEI Y J, et al. Influence of particle size and ionic strength on the freeze-thaw stability of emulsions stabilized by whey protein isolate[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(4): 922-932. DOI:10.1016/j.fshw.2022.03.018.

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅