Introduction

衰老及衰老相关疾病的发生，是困扰现代人类健康的一大难题。衰老通常是指随着年龄增长，人类身体机能等各方面出现的退行性改变。细胞是机体组成的基本单位，机体的衰老是由于衰老细胞的积累导致的。许多年龄相关疾病的发生和发展都与细胞衰老有关。

黑灵芝（Ganoderma atrum）是我国传统的药食两用天然真菌。黑灵芝多糖是黑灵芝中最主要的活性成分，具有抗炎、抗衰老、降血糖和调节免疫功能等多种活性功能。DPPH和超氧阴离子自由基清除实验发现，黑灵芝多糖具有良好的体外清除自由基功能。体内实验表明，腹腔注射黑灵芝多糖4周可呈剂量依赖缓解衰老小鼠大脑氧化应激、免疫功能障碍和年龄相关性氧化损伤。体外研究也表明黑灵芝多糖具有良好的抗衰老功效。在aβ肽处理的原代培养神经元细胞模型中，黑灵芝多糖已被证明是治疗阿茨海默（老年痴呆症）的有效方法。

自噬是一种通过溶酶体降解受损细胞器和蛋白质的过程，在抗衰老干预中起着至关重要的作用。多项研究表明，自噬具有积极的抗衰老作用。神经元的衰老似乎是由功能性自噬阻止的。亚精胺通过激发自噬来改善老年人B细胞的功能。

在前期研究中发现，黑灵芝多糖在缓解过氧化氢诱导的细胞衰老的过程中，上调了自噬相关通路，然而，很少有文献报道黑灵芝多糖通过自噬缓解细胞衰老，并描述其作用机制。因此， 南昌大学食品学院聂少平教授团队 在本文以过氧化氢诱导的衰老A375细胞为研究对象，探究了黑灵芝多糖（PSG）的抗衰老作用及其机制。

Results

PSG缓解过氧化氢诱导的细胞衰老

衰老相关β-半乳糖苷酶（β-Gal）是细胞衰老的标记物，如图所示，PSG呈剂量依赖性降低了过氧化氢作用后A375细胞的衰老阳性比例（蓝染率）（图A和B）。这说明PSG能够缓解过氧化氢诱导的细胞衰老。衰老相关DNA损伤指标γ-H2A.X的免疫荧光检测也显示了同样的结果（图C和D）。

图1 PSG可减轻H2O2诱导的A375细胞衰老和DNA损伤

PSG通过TFEB激活衰老A375细胞的自噬

自噬标记蛋白LC3的检测结果显示，PSG提高了衰老A375内LC3的表达（图A和B）。紧接着，作者又检测了溶酶体功能和自噬溶酶体转录因子TFEB的核内表达水平。溶酶体是自噬的关键细胞器，对溶酶体进行Lysosensor染色的结果显示，溶酶体酸性增强（图C和D）；与此同时，TFEB核内表达量增加（图E和F）。以上结果表明，PSG通过TFEB增强了溶酶体功能，进而激活细胞自噬。

图2 PSG通过衰老A375细胞中的TFEB激活自噬

PSG缓解了细胞线粒体功能障碍

通过DHE染色对细胞内ROS水平进行检测，发现PSG降低了ROS水平（图A和B）。分别用JC-1和Mitotracker进行染色，JC-1是一种线粒体膜电位染料，绿色比例的下降说明膜电位崩溃状况的缓解（图E和F）；Mitotraker 红色的增多显示了同样的结果（图C和D）。

图3 PSG逆转线粒体功能障碍

PSG通过自噬降低细胞内ROS水平

过氧化氢会导致细胞内ROS水平异常升高，而在PSG处理后的衰老细胞中ROS水平显著降低。为了探究ROS降低是否与自噬水平上调有关，使用自噬抑制剂Bafilomycin A1（Baf A1）和自噬激活剂Rapamycin（RAPA）对自噬进行干扰，发现在自噬被抑制的情况下，ROS水平上升，而自噬被激活的情况下，ROS水平下降（图A和B）。表明衰老细胞内ROS水平的降低确实与细胞自噬有关。

ROS水平下降能够缓解线粒体功能障碍

接着，通过使用ROS清除剂NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)探究ROS水平与细胞线粒体功能障碍的联系。结果显示，ROS导致的线粒体功能障碍可被NAC缓解（图C、D、E和F）。线粒体功能障碍是细胞衰老的重要成因和标志，该结果说明，ROS水平的下调，改善了衰老A375细胞的线粒体功能障碍，进而缓解了细胞衰老。

图4 PSG通过促进自噬来抑制ROS的产生

Conclusion

本研究结果验证了黑灵芝多糖在体外模型的抗衰老效果，并表明其作用的主要机制是通过激活细胞自噬，缓解线粒体功能障碍来实现的。

作者简介

第一作者

郭宓，南昌大学食品学院硕士研究生。

通信作者

周兴涛，博士，副教授，南昌大学食品学院教师

通信作者

聂少平，博士，教授，南昌大学食品学院院长，南昌大学食品科学与技术国家重点实验室成员，中国-加拿大食品科学与技术联合实验室（南昌）中方负责人。享受国务院特殊津贴专家，国家高层次人才特殊支持计划领军人才（2018年），国家自然科学基金杰出青年基金、优秀青年基金项目获得者，科技部中青年科技创新领军人才，教育部新世纪优秀人才，江西省高等学校“井冈学者”特聘教授，江西省主要学术学科带头人。担任Food Frontiers主编，Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre副主编，Journal of Agricultural and Food Chemistry、Current Topics in Nutraceutical Research、Food Science and Human Wellness等杂志编委，中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程专业委员会第十届理事会副理事长。主要从事食品化学与营养学、食品安全与分析、食品复杂碳水化合物（主要为生物活性多糖与膳食纤维）等领域的研究工作。

Ganoderma atrum polysaccharide relieves mitochondrial dysfunction to alleviate hydrogen peroxide-induced senescence via activating autophagy

Mi Guo, Ke Zhang, Duoduo Zhang, Yujia Zhou, Linyuan Liu, Yu Wu, Xingtao Zhou*, Shaoping Nie*

State Key Laboratory of Food Science and Technology, China-Canada Joint Laboratory of Food Science and Technology (Nanchang), Key Laboratory of Bioactive Polysaccharides of Jiangxi Province, Nanchang University, Nanchang 330047, China

*Corresponding authors.

Abstract

Polysaccharides from genus Ganoderma have prominent anti-aging effect, but their mechanisms are incompletely clarified. In our previous experiments, Ganoderma atrum polysaccharide (PSG) was exhibited to significantly alleviate senescence and DNA damage of A375 cells. To investigate its underlying mechanism, we conducted RNA-Seq analysis and found that PSG upregulated autophagy and mitochondria pathways compared to the model group. Further experiments showed that PSG relieved mitochondrial dysfunction via inhibiting the accumulation of reactive oxygen species (ROS) and loss of the mitochondrial membrane potential (MMP). Meanwhile, PSG activated autophagy and enhanced lysosomal function through transcription factor EB (TFEB). Interestingly, the pretreatment of autophagy inhibitors bafilomycin A1 (Baf A1) reversed the ROS decline induced by PSG, which subsequently increased cellular senescence of A375. In addition, PSG had a similar anti-aging effect on normal fibroblast WI-38. Taken together, PSG might reduce ROS levels through activating autophagy, which in turn suppressed mitochondrial dysfunction and cellular senescence.

Reference:

GUO M, ZHANG K, ZHANG D D, et al. Ganoderma atrum polysaccharide relieves mitochondrial dysfunction to alleviate hydrogen peroxide-induced senescence via activating autophagy[J]. Journal of Future Foods, 2022, 2(3): 241-252. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.06.005.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅