点评摘要

目前能够实现靶向基因激活的技术相当稀缺，RNAa是唯一进入临床验证的靶向基因激活技术。RNAa能为无法成药的基因功能缺陷性疾病带来全新的治疗方法，有十分广阔的应用前景。预计在RNAa发现20周年之际，即2026年会迎来第一个saRNA药物的获批上市。

——中美瑞康 李龙承博士

RNA激活（RNAa）是一种由小双链RNA（dsRNA）介导的基因调控机制，靶向启动子等基因调控序列，在转录和表观遗传学水平发挥作用。RNAa的发现完全出于偶然。2006年，李龙承等在研究抑制E-cadherin基因转录的过程中设计了两种靶向E-cadherin启动子的dsRNA，转染到肿瘤细胞后明显提高了E-cadherin mRNA和蛋白水平。研究人员又设计了靶向p21WAF1/CIP1（p21）和血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的dsRNA，同样上调了相应基因，并将这种现象命名为RNAa，将促进基因表达的小分子dsRNA称为小激活RNA（saRNA）。


RNAa的机理与生物学

目前，由于对RNAa作用机理了解并不透彻，这种技术的应用尚未普 及。研究表明，RNAa技术可能涉及到转录与表观水平的变化，同时需要多种酶参与。 saRNA装载到位于细胞质的Argonaute（Ago）蛋白上，丢弃有义链，保留反义链为引导链，和Ago蛋白组成复合物。该复合物能够经主动运输途径或有丝分裂方式进入细胞核，在RNA链的引导下特异性地识别并结合到启动子的基序上，通过改变局部空间构象介导相关序列组蛋白乙酰化和/或甲基化状态的改变，从而启动相应基因的转录，激活目的基因的表达。

由于saRNA上调基因表达的作用与siRNA截然相反，因此这两者经常被放在一起进行比较。二者具有一定的相似性：（1）saRNA和siRNA均由21对核苷酸组成；（2）二者发挥修饰功能时都需要Ago参与。但是，RNAa的作用过程与RNAi也有明显不同之处。RNAa需要在saRNA转染后1-2天才显现活性，而RNAi最快可在数小时内观察到活性，这可能是由于RNAa作用更复杂（如saRNA需要穿过核膜）。但是，RNAa技术对基因的调控效应持续时间（近2周）比RNAi（仅5-7天）更长，这一现象同时在靶向孕酮受体（PR）、p21、E-cadherin等基因的saRNA中观察到，这可能是因为在saRNA被降解清除后表观遗传修饰持续存在。

RNAa技术在肿瘤治疗中的应用

许多研究将RNAa技术用于实验性肿瘤治疗和基因功能研究。结果表明，saRNA可安全有效地调控基因表达，对非特异性基因组位点不会造成干扰。


调控细胞周期和细胞增殖

p21是p53肿瘤抑制蛋白的下游靶点，是一种调节细胞周期重要的细胞周期蛋白依赖的激酶（CDK）抑制剂。RNAa上调p21后细胞周期停滞在G1/G2，可抑制包括前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、胰腺癌和膀胱癌细胞的增殖。


促进凋亡

凋亡通路失调将导致癌症发生是学界共识。一些肿瘤抑制因子可以使肿瘤细胞在体内外对凋亡敏感性增强，因而可以利用saRNA触发肿瘤凋亡，获得抗肿瘤活性。在非人类灵长类动物细胞中转染p53 saRNA，聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（PARP）断裂增多，caspase依赖的凋亡激活。 肿瘤高甲基化基因1（HIC-1）是一种由于超甲基化作用往往低表达的抑制性基因（基因发生超甲基化后，多下调该基因的表达；反之，基因的低甲基化多上调该基因的表达）。RNAa介导HIC-1重新表达，可导致肿瘤细胞停滞于G0/G1期，从而抑制细胞增殖和迁移，诱导乳腺癌和胃癌细胞凋亡。

dsVHL-821是一种靶向VHL基因启动子的saRNA，可以在mRNA和蛋白水平上调VHL，在肾细胞癌769-P细胞中有效抑制细胞增殖。机理研究显示，dsVHL-821是以剂量依赖的方式上调p53、下调Bcl-xL，激活caspase 3/7和聚ADP-核糖多聚酶诱导肿瘤细胞凋亡，表明以saRNA激活VHL可能是一种肾细胞癌的新型治疗方法。


抑制侵袭和转移

侵袭和转移是肿瘤进展的关键驱动因素。E-cadherin缺失是上皮间质转化的重要节点，与多种实体瘤肿瘤侵袭能力增强有关。RNAa可恢复E-cadherin表达，在乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌细胞中同时抑制肿瘤细胞侵袭和转移。此外，RNAa介导的KLF4过表达可通过上调KLF4下游靶标金属蛋白酶的组织抑制因子2（TIMP2）来抑制前列腺癌的侵袭和转移。


诱导细胞衰老

细胞衰老是指细胞在内源性或外源性应激信号作用下发生的终末增殖停滞。在肿瘤发生的早期阶段，致癌激活可以触发类衰老生长停滞。因此，衰老被认为是一种抗肿瘤机制。研究表明，在肿瘤中恢复p53功能可以通过细胞衰老抑制肿瘤生长，促进清除肿瘤细胞，而对正常组织几乎没有影响。


逆转化疗耐药

原发性耐药和获得性耐药是肿瘤治疗的挑战。在一项研究saRNA能否提高肿瘤细胞对顺铂敏感性的试验中，转染p21 saRNA的肺癌细胞同时以顺铂处理。结果表明，RNAa介导的p21功能活化增强了顺铂在A549细胞中的化疗敏感性。同时，体内实验表明p21 saRNA与化疗可以对肺癌具有协同作用。

研究肿瘤中基因功能

基于saRNA的基因激活方法，在传统的功能获得（gain-of-function）技术之外，提供了另一种研究基因功能的技术。RNAa可以同时调控内源性靶基因及相关的剪接变体的转录。由于剪接变体在不同细胞类型及其不同阶段中具有不同的功能，saRNA的这种功能非常关键。基于载体的过表达系统是评价肿瘤细胞抑癌基因或癌基因功能的传统方法，由于结构中并不包括内含子和非翻译区调控元件，不能上调这些变体表达。此外，相较于基于载体的过表达系统，saRNA介导的基因激活更容易测量。

除了在肿瘤治疗方面的应用，今年5月发表的李龙承等的最新研究表明，saRNA还可用于恢复听力。耳毛细胞的损失会导致哺乳动物不可逆的声学损伤，ATOH1是耳毛细胞发育和再生的关键基因。李龙承等人设计的15种靶向ATOH1基因的saRNA经293T细胞和人脂肪间充质干细胞筛选后，其中3种可以有效激活ATOH1基因表达，因此RNAa技术为耳毛细胞再生提供了一种新的策略。

RNAa应用的挑战与考虑

选择最佳靶点

选择靶基因位点对于设计saRNA非常重要。一些研究表明，启动子和基因3’末端可有效激活基因表达。而RNAa最有效的靶标是相对于转录起始位点的上游。有研究表明，saRNA通过靶向域转录起始位点重叠的序列激活PR基因转录。另有研究揭示，RNAa介导的基因活化受到DNA超甲基化作用的影响(DNA甲基化对RNAa具有抑制作用)，因此同时需要避免saRNA靶序列中含有CpG岛。

脱靶效应

短dsRNA可能以序列特异或非特异性（如干扰素反应）方式导致脱靶效应，导致不需要的基因激活。为了避免序列特异性脱靶效应，靶核苷酸序列应与人类基因组中其他核苷酸序列不具明显的同源性。对于saRNA的结构改造可以避免脱靶效应。此外，建议利用基于载体的过表达方式验证RNAa特异性。

除以上两点，RNAi的许多挑战同样适用于RNAa技术，例如核酸药物的靶向递送能力等。


RNAa疗法的临床进展

肿瘤发展过程中往往伴随多种抑癌基因的低表达，RNAi技术对这一现象无能为力，而RNAa技术是一种很有前途的基因特异性治疗方式。RNAa无需担忧外源性基因序列整合到宿主基因组中的风险，特异性高。目前，全球布局saRNA产品管线的代表性公司为MiNA Therapeutics和中美瑞康。

MiNA Therapeutics

MiNA Therapeutics成立于2008年，旨在利用RNAa机制恢复或增强患者细胞的正常功能。公司搭建了体系化的研发平台，可以将提出想法到临床试验的时间压缩到2年，并获得SMARTICLES ®脂质体递送技术的独家授权，用于开发临床候选药物MTL-CEBPA。

来源：MiNA Therapeutics官网

目前，MiNA领先产品MTL-CEBPA已进入临床试验阶段。1月25日，MiNA启动了MTL-CEBPA与索拉非尼联用治疗晚期肝细胞癌二线疗法的临床II期试验。MTL-CEBPA是首个特异性上调CCAAT/增强子结合蛋白α（CEBPA）的疗法，通过将CEBPA恢复到正常水平可以减少对骨髓细胞的免疫抑制作用。临床Ib期试验中CEBPA与索拉非尼联用实现了13%的完全缓解率 (CRR) 和27%的总缓解率 (ORR)，而单独使用索拉非尼的CRR <1%和ORR为5%-11%。此外，MTL-CEBPA同时与阿特珠单抗、贝伐珠单抗联用用于肝细胞癌一线疗法的临床试验、与帕博利珠单抗联用用于治疗进展期恶性实体瘤均已进入临床I期试验。

除了MTL-CEBPA这一项目，4月11日，MiNA公布了MTL-STING临床前概念验证性数据。结果表明，MTL-STING可以通过RNAa技术上调STING蛋白和下游天然免疫相关信号通路，增强现有肿瘤疗法的有效性。STING是一种对免疫系统识别肿瘤细胞至关重要的蛋白，STING下调是肿瘤免疫逃逸的关键机制，也是天然免疫cGAS-cGAMP-STING途径失活的根本原因。目前，很多小分子激动剂作用于cGAS-cGAMP-STING途径，但患者获益有限，这些小分子不能解决STING本身下调的问题，同时还存在安全性和生物利用度的缺陷。MTL-STING可将STING mRNA的产量上调5倍，可有效恢复肿瘤患者中STING稳态，作用持续。该药物预计2023年进入临床I期。

融资方面，2020年9月，MiNA获得由以色列最大的健康技术和生命科学风投基金aMoon领投的3000万美元A轮融资。2021年7月，MiNA宣布与礼来公司达成最终协议，礼来将对MINA直接进行股权投资，金额约1500万美元，公司官网显示，双方将围绕5个靶点开展saRNA产品开发。

MiNA Therapeutics产品管线（来源：MiNA Therapeutics官网）

中美瑞康

来源：中美瑞康官网

2017年，中美瑞康由李龙承博士等人成立于江苏南通，面向全球市场致力于开发以RNAa技术为核心的创新型药物与疾病治疗方法。2021年2月，中美瑞康完成了由高瓴创投领投的1700万美元A轮融资；今年1月27日又完成近2亿元人民币的A+轮融资。

目前，中美瑞康已经建立了世界领先的RNAa药物发现与开发平台，公司产品管线包括10多个新药项目，全部拥有自主知识产权，涵盖单基因遗传病、肿瘤、眼科、肝脏、中枢神经系统等疾病领域。

公司专有的智能化学辅助递送SCAD™可将saRNA药物靶向递送至肝外组织（如中枢神经系统）；利用智能多样化连接基团SDL™搭建的N-乙酰半乳糖胺-寡核苷酸肝脏递送系统GOLD™具有出色的肝靶向能力。

临床开发方面，中美瑞康有5个项目已经完成体内概念验证，2个项目进入IND-enabling开发，预计2023年会进入I期临床试验。

中美瑞康产品管线（来源：公司官网）

专家点评

中美瑞康 联合创始人、总裁兼CEO

李龙承 博士

李龙承博士，中美瑞康联合创始人&CEO，2004年获得华中科技大学临床医学博士学位，2008年获得海外杰青，2017年江苏省“双创人才”创业类获得者，2021年江苏省“双创团队”领军人才。曾任美国加州大学旧金山分校(UCSF) 终身制副教授，中国医学科学院北京协和医院特聘教授、中心实验室主任。2006年在国际上首次发现并命名“RNA激活”现象，从而开创了一个全新的研究领域。在国际学术期刊发表论文80余篇，总引用次数12000余次，授权4项RNA激活相关的美国专利。

作为RNA激活的发现者和先行者，2017年李龙承博士在江苏创立中美瑞康，率领团队继续对RNA激活及系列相关技术进行成果转化和产业化，已开发第二代RNAa（RNAa 2.0）平台技术和全球领先的小核酸肝外递送技术，并建立10余个saRNA药物研发管线。

  • RNAa的独特技术优势

小核酸“信息”药解决了优质靶点稀缺问题，但目前大多数药物属抑制疗法，比如siRNA药物，因此，基因调控领域还存在巨大未满足的临床需求。目前能够实现靶向基因激活的技术相当稀缺，RNAa是唯一进入临床验证的靶向基因激活技术。和RNAi技术一样，RNAa利用小核酸提供基因序列的靶向性，以实现对靶基因的干预。不过，与RNAi不同的是，RNAa干预基因的结果是提高基因表达水平，来恢复蛋白的天然功能。因此，RNAa能为无法成药的基因功能缺失性疾病带来全新的治疗方法，有十分广阔的应用前景。

小激活RNA药物在开发过程中与其他小核酸药物一样，存在一些共性问题，比如脱靶、免疫刺激、肝外递送等，也有其独特的开发难点与应对策略，包括靶点序列的设计、序列结构的优化与化学修饰的模式。

  • 第二代RNAa（RNAa2.0）平台技术

中美瑞康拥有专有的第二代RNAa（RNAa2.0）平台技术及全球领先的小核酸肝外递送技术。RNAa2.0技术平台通过信息生物学分析、合理化设计和化学修饰，在RNAa药物发现与开发方面能够做到增强RNAa活性的同时，降低脱靶效应、降低毒性和免疫刺激。依靠RNAa2.0，中美瑞康解决了RNAa技术面临的重大技术难题，先导saRNA发现与验证目前成功率可接近100%，实现了对几乎任何基因的有效激活，极大提高了saRNA药物设计与新药发现的效率及候选化合物的成药性。

中美瑞康的SCAD（Smart Chemistry-Aided Delivery, 智能化学辅助递送）是一个通用性的可实现高效和持久小核酸药物肝外递送的技术平台。 SCAD是一种内置于治疗性双链 RNA（例如 siRNA 和 saRNA）中的新型递送系统 ，具有广泛的组织分布、高效的细胞摄取和内吞体逃逸能力，表现出优良的体内活性与安全性，且工艺放大简单。

借助这些底层平台技术，中美瑞康瞄准单基因遗传病、肿瘤、肝脏疾病等疾病领域，搭建了10余个药物研发管线，其中5个项目已经完成体内概念验证，2个项目进入IND-enabling开发，包括一个肿瘤和一个神经退行性疾病项目。领先项目预期在2023年下半年向美国FDA申报IND并启动I期临床。

  • 肿瘤之外，大有可为

肿瘤只是RNAa技术潜在的应用领域之一，还有大量的非肿瘤疾病，包括一些传统制药技术不可成药的疾病适合用RNAa来开发疗法。中美瑞康目前的管线布局是以单基因病为重点，特别是靶点在中枢神经系统和肝脏表达的单基因疾病。这些单基因疾病有的是因为单个基因突变导致的基因功能缺失，RNAa直接激活致病基因而恢复基因的功能；还有的是基因A突变导致基因功能缺失，基因B的激活能够代偿基因A的功能。除了单基因疾病，还有大量无基因突变但由于各种原因所致的正常基因的表达水平低下而引起的疾病，比如各种代谢疾病、神经退行性疾病等等。

  • RNAa发现20年之际，或迎来首款上市产品

RNAa机制还有待深入研究，可喜的是，近年来有多个研究小组在RNAa机制与生理作用研究方面取得了长足的进展，包括发现了更多的内源性miRNA介导的RNAa现象及参与这些过程的关键蛋白因子。

目前，小核酸药物中的反义寡核苷酸（ASO）已有9款药物获批，小干扰RNA（siRNA）有5款药物获批；saRNA技术已进入临床II期研究，但尚无药物上市，其发展空间和市场前景十分值得期待。预期在RNAa发现20年之际，即2026年会迎来第一个saRNA药物的获批上市。

参考资料：

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