“用非天然氨基酸与非天然碱基可以建构一个全新的世界。”北京大学药学院化学生物学系教授、博士生导师表示。

作为人体细胞和组织的重要成分，蛋白质由 20 种天然氨基酸以不同的比例组合而成，不仅种类丰富，性质和功能也各有不同。

在蛋白质的合成过程中，基因序列发挥重要的指导作用。基因序列转录形成 mRNA, mRNA 经由核糖体翻译形成多肽链。其中，tRNA 在读取 mRNA 密码子、转运单个氨基酸以合成多肽链的过程中发挥重要作用。

正常翻译至终止密码子后，由多个氨基酸以“脱水缩合”方式生成的多肽链，就会从 tRNA 上切割下来，并进一步盘曲、折叠，最终生成蛋白质这种具有一定空间结构的物质。

如果因为某个碱基的改变，导致正常编码某种氨基酸的三联体密码子突变为赭石型（UAA）、琥珀型（UAG）、蛋白石型（UGA）这三种不能编码氨基酸的终止密码子，就会使肽链的合成提前终止，产生截断的功能缺陷甚至无功能的蛋白。这种突变称为无义突变，是一种重要的致病性突变，约占单基因遗传病的 11%。

作为治疗无义突变罕见病的一种技术手段，基因密码子拓展技术可以借助相关编码工具，在蛋白的无义突变位点精准引入非天然氨基酸，以实现提前终止密码子（premature termination codon, PTC）的通读及功能蛋白的全长表达。

多年来，教授及课题组专注于前沿生物技术及再生医学的研究领域，借助免疫学、神经科学、临床医学、无机化学等多重交叉学术背景提供的新颖且丰富的研究视角，攻克了生命科学和医学方面的诸多前沿难题。

图 | 夏青教授及团队成员（来源：）

在无义突变罕见病的治疗方面，该课题组曾借助基因密码子拓展技术，实现了杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）小鼠模型中 Dystrophin 蛋白的完整表达。据悉，将该技术应用于 DMD 的治疗，在全球范围内属于第一次。近期教授陆续在密码子拓展技术的开发、非天然氨基酸应用的拓展、药物评价模型及体系构建等方向发表了一系列研究成果，不断为无义突变罕见病的治疗以及新型疫苗的开发评价提供更为完善的策略及工具。

首次实现在哺乳动物细胞中联用三套非天然氨基酸系统，为无义突变罕见病治疗提供新策略

非天然氨基酸（Non-canonical amino acids），是相较于人体内仅有的 20 种天然氨基酸来说的。由于后者携带的功能基团数量较为有限，无法满足人们在生物科学研究和应用中对蛋白质结构和功能的需求。目前，虽然能采用基因改造等方法对蛋白质翻译后修饰的关键通路进行调节，但相关科学机理的揭示以及可改变的修饰类型较为有限。

非天然氨基酸可位点特异性地引入目标蛋白，且对蛋白结构的扰动较小，通过更换氨基酸的侧链基团更可实现修饰蛋白的功能多样化，在细菌、哺乳动物细胞等的蛋白质修饰中表现优秀，拥有广阔的发展空间。

同时，基因密码子拓展技术也在过去的二十年中，从朴素的设想发展成为有力的研究工具。该技术既能实现具有新功能或增强功能的蛋白质生物合成，又能把拥有不同功能的非天然氨基酸定点整合进细胞和动物的蛋白质中，不但为理解和控制生物功能提供了变革性思路，还解决了经典蛋白质工程无法解决的重要问题。

但是，在哺乳动物细胞中联用多套非天然氨基酸系统，对研究人员来说仍是个艰巨的挑战。

为了更好地解决问题，课题组从通读效率和正交性两方面选择了三种非天然氨基酸掺入系统的最优组合，通过对 MmPylRS/tRNAMmPyl、EcTyrRS/tRNAEcTyr和EcLeuRS/tRNAEcLeu 的优化，使其分别解码哺乳动物细胞中的三种无义密码子，也即 UGA、UAA 和 UAG，并编码不同功能的非天然氨基酸。

2022 年 7 月 11 日，相关论文以《优化 eRF1 以实现哺乳动物细胞中三种非天然氨基酸的遗传编码》（）为题在 Advanced Biology 上发表[1]。

图 | 相关论文（来源：Advanced Biology）

该研究首次实现在哺乳动物细胞中，将三个不同的非天然氨基酸位点特异性地整合到一个蛋白质中，建立了在真核体系中进行多位点特异性蛋白修饰的新工具，突破了合成生物学领域的一道壁垒，为无义突变罕见病的治疗提供新的策略。

通常，在蛋白质翻译过程中，借助氨酰 tRNA 合酶（aaRS）的催化，游离的氨基酸会与对应的 tRNA 生成氨酰 -tRNA，然后通过肽链与上个被插入的氨基酸形成肽键，再插入到肽链中。

因为正常细胞内并没有能够识别终止密码子的 tRNA 和对应的氨酰 tRNA 合酶，所以要想将非天然氨基酸插入到蛋白质的这些位点上，细胞内必须有对应 tRNA 和氨酰 tRNA 合酶的表达，并符合生物的正交原则。也就是说，这个非天然氨基酸只能被对应的 tRNA 和氨酰 tRNA 合酶携带和催化，且这对 tRNA 和氨酰 tRNA 合酶也只能催化、携带这个对应的非天然氨基酸。

图 | 基因密码子扩展系统的翻译元素示意图（来源：Advanced Biology）

解释道：“实际上，只能在提前终止密码子的地方插入非天然氨基酸。”

由三个正交的 aaRS/tRNA 对组成的抑制系统，可以在单个哺乳动物细胞内响应三个终止密码子特异性调控红色、蓝色和绿色的荧光蛋白（即 RFP、BFP 和 GFP）表达。

同时，为了提高三种非天然氨基酸与单个蛋白的结合效率，该团队还系统地研究了 15 种不同的真核释放因子 1（eRF1）突变组合对三种非天然氨基酸系统的影响，并对 E55R、E55D、N129P 和 Y125F 这四个 eRF1 突变体进行改造，这些改造显著提高了非天然氨基酸系统在哺乳动物细胞中的编码效率，从 0.78% 提高到 11.6%。

图 | 通过三个无义抑制系统实现三个蛋白质或单个蛋白质表达的开关（来源：Advanced Biology）

谈及为何要在真核细胞而非更简单的原核细胞中进行基因密码子拓展技术的研究，表示：“做蛋白质表达时，如果要表达一个与人体内蛋白类似的，能够有正常折叠、翻译后修饰的蛋白，需要在哺乳动物细胞里完成，否则生成蛋白的功能是不完整的。这对于开展无义突变疾病的研究来说，也是一样的。”

她补充说道：“真核和原核体系的关键区别在于终止机制，也就是核糖体去翻译 mRNA 变成蛋白的过程，原核和真核不同。真核细胞中的终止机制更为复杂，所以我们解决了真核里影响终止机制的问题，包括对 eRF1 的改造。我们改造了它的四个位点，把这四个位点的突变体同时转给一个细胞，这对于治疗无义突变疾病才有更好的借鉴意义。”

用 AI 辅助非天然氨基酸插入蛋白质的合理设计，助推实现无义突变位点的预测

随着 AI 技术不断深入发展，科研人员也开始用它来解决自然科学研究过程中遇到的问题。AI+Science 已经成为全新的科研范式，并在材料发现、药物研发、癌症治疗等方面发挥重要作用。

如今，AI 已在蛋白质结构预测领域取得一系列里程碑式的进展。比如， 公司开发的 AI 系统 AlphaFold，可以预测地球上几乎所有已知生物体的大约 2 亿种蛋白质的结构。

诸如 AlphaFold2、RoseTTAFold 等蛋白质预测工具，可以从蛋白质的一级序列准确预测出蛋白质的三级结构，不过并不支持对一级序列中包含非天然氨基酸的蛋白结构预测。

为了实现对任意非天然氨基酸插入任意蛋白上任意位点的成功概率和效率的预测，团队开发了一款 AI 辅助非天然氨基酸插入蛋白质的软件。

2022 年 9 月 8 日，相关论文以《机器学习辅助非天然氨基酸插入蛋白质的合理设计》（）为题在Computational and Structural Biotechnology Journal 上发表[2]。

图 | UAA 引入蛋白质效率的预测（来源：Computational and Structural Biotechnology Journal）

这项研究将 AI 应用于含非天然氨基酸蛋白的合理设计和虚拟筛选中，整理规范了此前非天然氨基酸 1221 个取代记录作为已知位点数据库，并对该库进行机器学习，把相关模型和算法编写成软件（Rational Protein Design with Unnatural Amino Acids，RPDUAA）。在研究病毒蛋白、无义突变致病的单基因蛋白或进行蛋白质修饰时，该软件能提供准确度在 80% 以上的插入非天然氨基酸位点的预测。

该研究首次实现非天然氨基酸替换天然氨基酸的深度学习和精准预测，有利于实现无义突变位点的选择性，助推开启含有非天然氨基酸的新型蛋白质药物设计。

“AlphaFold 只能用现成的 20 种氨基酸去做模拟，加上任何一个带侧链的非天然氨基酸，这个软件都无法正常工作。因为我们插入了非天然氨基酸在容易突变的位点进行治疗，所以就想做一个在引入非天然氨基酸以后，依旧能够预测蛋白质结构的软件。”说。

提到软件的开发目的，她解释说，“目前还只是第一步，我们在已有的蛋白上插入了非天然氨基酸，并找出一些规律，又开展了对蛋白质位点的验证。未来我们希望这个软件能用于蛋白药、抗体生产、病毒包装、非天然氨基酸的选择等多个方面。因为非天然氨基酸是我们的工具，所以这个软件对我们来说也是很必须的。”

建立评价体系和系列评价工具，为疫苗和抗病毒药物研发寻找新方向

人类与病毒经历了漫长的抗争史。在抗病毒过程中，疫苗和抗病毒药物成为人类对付病毒的有力武器。

在大规模使用抗病毒药物进行化学预防和治疗的过程中，不可避免地会使病毒发生耐药性的进化。近年来，人类免疫缺陷病毒-1（Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）和甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）都已出现了高度耐药性，这大大增加了病毒大流行的风险，也对抗病毒策略的进一步开发提出了迫切要求。

对此，团队提出了一种抗病毒方法，利用密码子拓展技术，高效生产非天然氨基酸工程化的缺陷病毒颗粒。

2022 年 7 月 1 日，相关论文以《非天然氨基酸工程粒子通过基因干扰作用治疗流感病毒感染》（）为题在 Advanced Therapeutics 上发表[3]。

图 | 相关论文（来源：Advanced Therapeutics）

携带缺陷基因片段的病毒缺陷干扰颗粒（DIPs），可以通过基因交换去干扰 IAV 的复制和包装，这种方法在巧妙应用病毒生物学特性的同时，不会诱导病毒产生耐药性，但 DIPs 在生产和治疗上较为低效，阻碍了该方法的进一步推进。

基于此，团队通过密码子拓展技术实现缺陷干扰颗粒的高效生产；这种非天然氨基酸工程化的病毒颗粒，因病毒聚合酶基因中含有无义密码子，其复制增殖具有高度可控性。

图 | 耐药非天然氨基酸病毒的构建（来源：Advanced Therapeutics）

工程化病毒颗粒兼具治疗性药物和预防型疫苗的双重作用，通过交换含有无义密码子的基因片段，能够高效且广谱地中和现行的流感病毒株和耐药流感病毒株，并不诱导产生新的耐药性。

基于大规模的平行实验研究，这种新型的抗病毒方法得到充分验证，有望用于更多新发流感病毒和其他 RNA 病毒的治疗及预防。

不仅如此，建立一个可操作的病毒感染及评价系统，也是推进抗病毒方法深入发展的有效举措。

为了研究病毒感染对人脑发育的影响和机制，团队提出利用成熟的类人脑器官培养模型，模拟流感、肠道等多种病毒的感染。

2022 年 7 月 7 日，相关论文以《建立基于类脑器官的流感病毒感染模型和抗病毒候选药物筛选方法》（）为题在 Theranostics 上发表[4]。

图 | 相关论文（来源：Theranostics）

在该项研究中，研究人员分别用流感病毒（H1N1-WSN 和 H3N2-HKT68）、肠道病毒（EV68 和 EV71）和发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）等多种病毒对脑类器官进行攻击，并探讨这些病毒对人脑发育的损害作用。

图 | 作为病毒感染模型的类器官（来源：Theranostics）

结果表明，被流感病毒感染的脑组织体，与 ZIKA 病毒感染一样，引起了整体组织体大小的下降，而被肠道病毒感染的脑组织体呈现出截然相反的结果。

同时，在对 H1N1-WSN 感染类器官的分子基础进行研究后发现，与 SOX2+ 神经干细胞（NSCs）和 GFAP+ 星形胶质细胞相比，WSN 优先感染 MAP2+ 神经元，诱导 NSCs 和神经元凋亡，释放炎症因子（TNF-α、INF-γ 和 IL-6），促进脑损伤。

研究人员还观察到，一些神经营养因子（如 BDNF、GDNF、NT3）和 PYC-12 药物，能够作为抗病毒和神经保护的试剂，显著抑制病毒感染、 NSCs 和神经元的凋亡以及炎症因子的释放。

将分化类器官作为药物筛选模型的该项研究，不仅能更好地应用于人体模拟，还能评价出物种特异性病毒感染的真实情况，有利于率先在肿瘤和抗病毒药物研发等领域取得突破。

与抗病毒药物用来治疗已经感染病毒的患者不同，预防型疫苗通常只有在感染病毒前接种才有效。

近几年来，新冠疫情大流行让人们将目光和希望更多地聚焦于疫苗的研发。目前，灭活新冠病毒疫苗已经广泛用于由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2（SARS-CoV-2）及其变种引起的 COVID-19 的预防性感染。

团队以北京科兴中维新冠灭活疫苗克尔来福（CoronaVac）为例，从免疫细胞功能检测、单细胞组学分析、蛋白质组、代谢组和脂质组学分析等多角度出发，详细解析了 CoronaVac 接种后的免疫特征及免疫分子机制。

2022 年 5 月 30 日，相关论文以《SARS-CoV-2 灭活疫苗（CoronaVac）免疫特性的综合分析》（）为题在 Vaccines 上发表[5]。

图 | 相关论文（来源：vaccines）

细胞来自接种 CoronaVac 疫苗的 13 名参与者和 12 名 COVID-19 的康复者的外周血单个核细胞（PBMC）。

图 | PBMC 的 scRNA 测序分析（来源：vaccines）

实验结果表明，与未免疫状态相比，增强免疫后（第 45 天）SARS-CoV-2 血清中和抗体的平均滴度明显增加。值得指出的是，血清中和抗体水平是目前通用的，评价病毒疫苗的重要指标。

“我们的目的其实并不仅仅在于评价疫苗的有效性，研究的核心目的在于观察外周的免疫应答，阐明病毒疫苗的细胞免疫功能机制。我们观察到一系列免疫细胞的序贯活化，其中 CD8+T 细胞的活性有可能是后续提高疫苗效果的关键指标，这为未来新型疫苗的研发提供了新的方向。”夏青评论道。

坚持基础科研为成果转化而生，围绕罕见病治疗成立三家公司

让基础科学研究为成果转化而生，是教授及团队多年来始终坚持的理念。目前，除了完成相关理论研究，建立了相应的评价体系和一系列评价工具，还有针对性地成立了围绕无义突变治疗的三家公司。

2021 年 9 月，（QiXia Decode Therapeutics）生物科技有限公司成立。公司平台主要有抑制性 tRNA 系统、密码子扩展系统、小分子通读系统三个方向，专注利用工程化 tRNA–酶（tRNA–enzyme pairs）治疗由无义突变引起的肌营养不良症等罕见病。

2021 年底，北京文心科尚科技有限公司创立，公司为聚焦罕见病的科普品牌。其初衷是希望无义突变患者能参与设计产品并发挥自己在这之中的作用，从而推动社会对无义突变罕见病的理解。

2022 年 5 月，北京青岩重编生物技术有限公司正式成立。该公司专注于对无义突变发病基因的解析，聚焦 AI-gene/cell/organ，主要完成生物细胞/单基因遗传疾病细胞的计算机编程。

“不管是完成了在真核细胞中三套非天然氨基酸系统的插入和比较，还是实现用 AI 软件精准预测插入非天然氨基酸的蛋白质的结构，这些研究的最终目的，都是想知道非天然氨基酸在蛋白中的插入位点，以及引入位点与纠正无义突变之间的密切联系，以便更好地推动无义突变罕见病的治疗。”表示。

支持：路雨晴、矽兮、LXS

参考资料：

1.N. Shi, L. Tong, et al. Optimizing eRF1 to enable the genetic encoding of three distinct Non-canonical amino acids in mammalian cells. Adv. Biol. （2022）. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35818694/

2.H. Zhang, et al. Rational incorporation of any unnatural amino acid into proteins by machine learning on existing experimental proof. Comput. Struct. Biotechnol. J. （2022）. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2022.08.063

3.X. Wu，Z. Zheng, H. Chen, et al. Sterilization of Drug-Resistant Influenza Virus through Genetic Interference Inspired by Unnatural Amino Acid-Engineered Particles. Adv. Thno. （2022）. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adtp.202200069

4.X. Zhang, H. Lin, L. Dong, Q. Xia. Recapitulating influenza virus infection and facilitating antiviral and neuroprotective screening in tractable brain organoids. Thno. （2022）. https://www.thno.org/v12p5317.htm

5.Z. Jiang，H. Lin，H. Zhang, et al. An Integrative Analysis of the Immune features of Inactivated SARS-CoV-2 Vaccine （ConoraVac）. Vac. （2022）. https://www.mdpi.com/2076-393X/10/6/878