蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种普遍存在于食物、土壤和人体皮肤等环境中的革兰氏阳性食源性病原菌，已经对食品安全和人类健康造成了严重的威胁。目前应对食源性病原菌对食品污染最为常用的一种手段是添加化学防腐剂，但是其造成的安全性问题正日益突出。而植物精油是由植物根、茎、果实等部位提取的生物活性物质，其抑菌能力已经得到证实，同时其还具有安全和不易产生抗药性等诸多优点，使其具有开发为天然防腐剂的潜力。

花椒的抑菌能力也得到了广泛的关注，其中花椒挥发油的抑菌能力已经得到证实，其能够抑制大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等多种食源性病菌。但是现有研究主要关注其抑菌活性，对其抑菌机理还鲜有报道。四川省农业科学院农产品加工研究所的赵 驰、董 玲、李治华*等首先对青花椒精油的化学组成进行分析，随后以蜡样芽孢杆菌为研究对象，通过理化、形态学和代谢组学的方法对其抑菌机理进行探讨，以期为青花椒资源的充分利用和进一步开发以青花椒为原料的新型抗菌药物提供参考。

1、青花椒精油的化学组成

青花椒精油的化学组成如表1所示、共鉴定出18 个化合物、占总峰面积的89.22%。其中主要包括芳樟醇（（30.69±0.17）%）、D-柠檬烯（（14.55±0.12）%）、伪柠檬烯（（9.08±0.24）%）、4-松油烯醇（（3.95±0.14）%）、β-月桂烯（（3.88±0.10）%）、α-松油醇（（3.69±0.08）%）、橙花叔醇（（3.34±0.07）%）、大牛儿烯D（（2.84±0.10）%）、乙酸芳樟酯（（2.83±0.07）%）和α-蒎烯（（2.67±0.03）%）。

2、青花椒精油对蜡样芽孢杆菌的抑菌活性

分别采用终质量浓度16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL青花椒精油处理蜡样芽孢杆菌，结果显示青花椒精油对蜡样芽孢杆菌的MIC和MBC分别为2.0、4.0 mg/mL。Diao Wenrui等发现青花椒精油对表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和枯草芽孢杆菌（均为革兰氏阳性菌）的MBC均为5.0 mg/mL，但对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抑菌能力较差，推测与细菌的细胞膜结构有关，革兰氏阴性菌外膜具有良好的亲水表面，导致亲脂化合物很难渗透。

3、青花椒精油对蜡样芽孢杆菌细胞壁的影响

AKP活力测定结果如图1所示，当使用MIC和MBC青花椒精油处理蜡样芽孢杆菌后，AKP活力分别为（0.24±0.04）、（0.30±0.03）U/109 cells，与空白组（（0.05±0.01）U/109 cells）相比活力升高，表明青花椒精油对蜡样芽孢杆菌的细胞壁造成了损伤，从而导致AKP外泄。

4、青花椒精油对蜡样芽孢杆菌细胞膜的影响

如图2所示，荧光信号主要集中在Q2和Q3象限，表明蜡样芽孢杆菌未能与Annexin V-APC结合，这可能与革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚有关。此外，CK组、MIC处理组和MBC处理组的坏死细胞比例（APC-/PI+）分别为（2.15±0.32）%、（97.77±0.98）%和（98.93±0.26）%。本研究结果表明，MIC和MBC青花椒精油处理能够破坏细胞膜完整性，并杀死绝大部分蜡样芽孢杆菌。

5、青花椒精油对蜡样芽孢杆菌形态的影响

扫描电子显微镜观察结果如图3所示，CK组的蜡样芽孢杆菌细胞排列紧密，细胞膜和细胞壁结构完整。而经MIC青花椒精油处理后，细胞严重皱缩，细胞膜破裂。经MBC青花椒精油处理后，蜡样芽孢杆菌细胞膜破损严重，细胞边界模糊不清，出现大量聚集。

透射电子显微镜结果如图4所示，未使用青花椒精油处理的蜡样芽孢杆菌细胞结构完整。当经过MIC处理后，细胞壁和膜破损，胞内物质流出严重，但是其内生孢子仍具完整的结构。当质量浓度提高到MBC时，细胞破损严重，细胞壁和细胞膜脱落，且内生孢子出现孔洞。推测高质量浓度的青花椒精油能够对蜡样芽孢杆菌的内生孢子结构造成影响。

6、青花椒精油对蜡样芽孢杆菌胞内代谢的影响

本研究共鉴定出63 个胞内代谢物，OPLS-DA分析（，Q2＝0.944）得分图如图5A所示，CK组和0.5 MIC处理组能够被明显区分，表明青花椒精油能够引起蜡样芽孢杆菌代谢紊乱。本研究共筛选出26 个VIP≥1、差异倍数≥1.5和P≤0.05的差异代谢物。将差异代谢物进行KEGG富集分析，结果如图5B所示，这些差异代谢物与精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330）、氨酰-tRNA生物合成（ko00970）、谷胱甘肽代谢（ko00480）、精氨酸生物合成（ko00220）、甘油酯代谢（ko00561）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（ko00260）和乙醛酸和二羧酸代谢（ko00630）通路有关。

细胞膜损伤相关代谢物分析结果

细胞膜损伤相关代谢物相对含量变化如图6所示，从代谢水平上分析，当使用0.5 MIC青花椒精油处理蜡样芽孢杆菌后，其胞内的脯氨酸相对含量相较于对照组，上升5.03 倍（图6L）。脯氨酸是一种具有多种功能的代谢物，其在渗透调节、活性氧清除和膜完整性保护等方面发挥着重要作用。该结果间接表明了青花椒精油能够对蜡样芽孢杆菌细胞膜造成影响。此外，与CK组相比，0.5 MIC处理组未检测到鸟氨酸（图6M），推测鸟氨酸在环脱氨酶的作用下转变为脯氨酸以应对细胞膜损伤。

如图6A～K所示，共检测出11 种脂肪酸，其中包括9 种饱和脂肪酸和2 种不饱和脂肪酸，其相对含量均明显下降。已有研究发现，细胞膜的通透性和流动性取决于细胞膜所含脂肪酸的饱和性。

能量代谢限制

在本研究中，柠檬酸和苹果酸的相对含量降低，而琥珀酸和谷氨酸的相对含量上升（图7），表明青花椒精油处理后蜡样芽孢杆菌胞内的柠檬酸循环发生紊乱。琥珀酸是柠檬酸循环中重要的中间产物，其在琥珀酸脱氢酶的作用下转换为富马酸。在本研究中，琥珀酸的相对含量升高可能是青花椒精油抑制了蜡样芽孢杆菌琥珀酸脱氢酶活力，导致其暂时性积累。此外，谷氨酸相对含量的升高也表明柠檬酸循环受到了影响，通常情况下谷氨酸与柠檬酸循环产物α-酮戊二酸呈高度平衡状态，柠檬酸循环的抑制会导致谷氨酸积累。乳酸是糖酵解的最终产物，其含量能够反映糖酵解活性。在本研究中，乳酸相对含量降低，表明青花椒精油对蜡样芽孢杆菌胞内糖酵解途径具有抑制作用。

氨基酸代谢紊乱

如图8所示，青花椒精油处理蜡样芽孢杆菌胞内氨基酸的合成和代谢途径也受到了干扰。与对照组相比，在被鉴定到的15 种氨基酸中有10 种相对含量降低，5 种相对含量升高。KEGG富集结果显示青花椒精油显著影响了氨酰tRNA生物合成的中间体。氨酰tRNA参与核糖体依赖蛋白质的合成和基本初级代谢过程，其作为适配体分子，连接mRNA的密码子和指定的氨基酸，在蛋白质的生物合成中起关键作用。对氨酰tRNA合成途径影响相关蛋白合成途径造成干扰，就会导致细胞增殖和信号转导受到影响。与对照组相比，青花椒精油处理蜡样芽孢杆菌胞内亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸3 种支链氨基酸的相对含量降低。支链氨基酸是代谢活动中不可缺少的代谢产物，在新分子和细胞的生物合成过程中提供能量和前体。

结 论

本研究通过多种技术方法对青花椒精油的化学组成及抑菌活性及机理进行了探讨。GC-MS分析结果表明烯、醇和酯类物质是青花椒精油化学组成中的主要成分，其中多种化合物已被报道具有抑菌活性。以蜡样芽孢杆菌作为研究对象时，青花椒精油表现出良好的抑菌效果，其MIC和MBC分别为2.0、4.0 mg/mL。为了探究其抑菌机理，本实验首先测定AKP活力，结果发现经过青花椒精油处理后，AKP活力上升，表明蜡样芽孢杆菌的细胞壁被破坏。同时，本实验进行了Annexin V-APC/PI双染色法流式细胞术分析以及透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察，结果发现青花椒精油能够破坏蜡样芽孢杆菌细胞壁和细胞膜的结构，导致胞内大分子物质流出，且MBC青花椒精油处理还能对内生孢子产生显著影响。本实验基于衍生化的方法在代谢水平上阐释了青花椒精油潜在的抑菌机制，结果显示青花椒精油能够显著影响蜡样芽孢杆菌脂肪酸的组成，进而改变其细胞膜的通透性，此外，其还能使蜡样芽孢杆菌能量代谢和氨基酸代谢紊乱，从而起到抑菌效果。这些结果可为青花椒资源的充分利用和进一步开发以青花椒为原料的新型抗菌药物提供参考。

通信作者简介

李治华，研究员，四川农业科学院农产品加工研究所发酵食品研究中心主任。
工作经历：
2004.7-2009.06 四川省农科院加工所 研究实习员
2009.07-2013.02 四川省农科院加工所 助理研究员
2013.02-2020.02 四川省农科院加工所 副研究员
2020.02-至今 四川省农科院加工所 研究员
主要研究成果：该课题负责人李治华博士入选科技部“2015 中韩青年科学家 交流计划”。主要从事传统发酵食品的研究与示范，具有宏基因 组分析、LC-MS 代谢分析、NMR 代谢产物分析，GC-MS 风味 成分鉴定的工作经历，在《Food Chemistry》《Journal of Applied Microbiology》、《食品科学》等 SCI、EI 期刊上以第一作者发表 论文 6 篇，授权（申请）相关专利 5 项，其中以第一、二发明人 获得国家发明专利授权 3 项，新申请一项（在实质审查阶段）， 主持国家自然科学基金青年基金 1 项，获国家科技进步二等奖 1 项。

第一作者简介

赵驰，助理研究员，四川农业科学院农产品加工研究所。
教育经历：
(1) 2019-09 至 今, 四川农业大学, 微生物学, 在读博士
(2) 2015-09 至 2017-07, 南京农业大学, 植物保护, 硕士
(3) 2011-09 至 2015-07, 安徽农业大学, 植物保护, 学士
科研与学术工作经历（博士后工作经历除外）：
(1) 2017-09 至 今, 四川省农业科学院, 农产品加工研究所, 助理研究员

本文《青花椒精油抑制蜡样芽孢杆菌的活性与机理》来源于《食品科学》2022年43卷17期64-73页，作者：赵驰，董玲，张凤菊，陈善波，胡文，赵跃军，黄志标，朱永清，李治华。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210906-072。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于 2022年12月3-4日 在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。