Nature | 张世成等解析化学遗传工具DREADD的设计原理

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化学遗传学是指通过对生物大分子实行改造，使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用，从而达到可控和可逆地 （伴随加入或除去化合物而启动或中断特定的反应） 控制生物大分子的活性，进而特异性地影响生理活动。2007年，DREADD技术的发明者Bryan Roth教授实验室利用定向进化的酵母筛选平台，成功获得可以被药理惰性化合物氧化氯氮平（Clozapine-N-oxide,CNO） 选择性激活的改造蕈毒碱型乙酰胆碱受体（muscarinic acetylcholine receptor,mAChR） 的化学遗传操作系统，并命名为DREADD（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）【1】。该系统具有极低的本底活性，完全丧失对于内源激动剂乙酰胆碱的反应，和能够被在药理学上呈现惰性的化合物CNO高效激活等三个重要特征。其中，hM3Dq和hM4Di是两种目前最广泛用于神经科学领域的化学遗传操作工具：hM3Dq用于激活神经元，而hM4Di则被用于抑制神经元活性【2-4】（图1）。DREADD系统相较于神经科学另一项广泛使用的操作工具——光遗传学【5】，具有非侵入性，无需特殊设备，可以长时间激活或抑制神经元活性，具有较强的医学转化可能等优点；不过也有调控的时间分辨率较差等缺点。此外，G蛋白偶联受体丰富的下游信号通路，也使得激活特征信号通路的DREADD系统得以开发。目前，以hM3Dq为模板，相继有Gs-DREADD (M3Ds) ，G12-DREADD (M3D12) ，b-arrestin DREADD (M3D R165L) 等DREADD系统被开发。以上DREADD系统也已经被广泛用于探索在体内特定细胞，组织或者器官中激活不同信号通路所产生的生理效应变化。比如，NIDDK的Jürgen Wess教授利用DREADD系统对于糖尿病的发生及药物开发进行了较为系统的研究【6】。

然而，作为目前广泛使用的DREADD激动配体 （Actuator） CNO在2017年发表的Science文章中被证明不能跨越血脑屏障发挥功能，而是其在体内的代谢产物氯氮平 （Clozapine） 激活了脑中表达的DREADD受体【7】。而Clozapine十分复杂的药理性质 （能够结合众多在大脑中高表达的受体【8】） ，使得其会导致多种多样的副作用。因而开发具有高代谢稳定性，高选择性，高效能的激动配体成为化学遗传学领域的一个重要课题。在后续的研究中，Bryan Roth教授实验室通过与其他实验室合作，相继开发了包括Compound 21【9】和去氯氯氮平 （Deschloroclozapine, DCZ）【10】等其他DREADD激动配体化合物。其中，DCZ是目前亲和力最高的，效能最好的激动配体【10】。此外，发现可以激活DREADD受体的已批准或者条件批准的药物对于DREADD系统的临床医学转化也具有重要意义，目前主要有Perlapine和Olanzapine这两种药物被验证可以分别激活hM3Dq和hM4Di【11,12】。

图1 DREADD系统工作模式及hM3Dq, hM4Di结合DCZ或CNO复合物的整体结构

值得注意的是，上述具有极低本地活性和十分优异配体选择性的DREADD系统仅仅通过引入两个位于配体结合口袋附近的单点突变 （Y3x33C和A5x461G） 便实现了以上效果。然而，DREADD突变如何实现上述效果，一直以来都并不清楚，因而也限制了DREADD系统的进一步改造和应用。

为了进一步阐明DREADD受体选择性激活的分子机制，理解DREADD系统的设计原理，2022年11月30日，美国北卡罗莱纳大学教堂山分校的Bryan Roth教授实验室与合作者 （共同一作为张世成和Ryan H. Gumpper） 在Nature杂志在线发表了题为Molecular basis for selective activation of DREADD-based chemogenetics的文章。通过对结合激动配体DCZ或CNO的hM3Dq和hM4Di复合物及结合内源配体类似物iperoxo的hM3R复合物等高分辨率电镜结构的比较分析，结合相应的生化，药理和分子动力学模拟实验，揭示了DREADD受体丧失本底活性，对内源配体不敏感，和其可以被激动配体激活的分子基础。以上信息将直接促进新型激动配体的后续开发，为构造其他新型DREADD系统提供思路，从而进一步丰富化学遗传操作工具，拓展DREADD系统的应用场景。

尽管在此之前，已有多个mAChR家族受体 （M1-M5） 的激活态和非激活态结构被报导，然而其中的激活态结构均结合内源配体乙酰胆碱 （Acetylcholine，ACh） 的类似物iperoxo。该配体分子在化学结构上与Clozapine及其类似物有很大不同（图1）。在受体结构上，相比于其他生物胺家族受体，mAChR家族的一个显著特征是其位于正构结合位点上方，彼此相互作用形成盖子结构 （Tyrosine lid） 的三个保守的酪氨酸 （Y3x33，Y6x51和Y7x38） 。这三个酪氨酸不仅可以直接和内源配体ACh或其类似物的正电荷形成pi-cation的强相互作用，而且也可以通过覆盖在其上方增强ACh或iperoxo在正构口袋里的结合（图2）。因此，DREADD突变直接破坏了该酪氨酸盖的结构，导致了受体对于ACh及其类似物亲和力的丧失。此外，该酪氨酸盖结构同时也介导了TM3-TM6-TM7胞外端的相互作用网络，因而其可能在维持受体本底活性中扮演重要角色。由于尚未有不结合配体和传感器蛋白的mAChR受体结构报导，作者将此次解析的hM3R-iperoxo结构与Alphafold2中预测的hM3R结构进行了比对，发现这三个酪氨酸以及D3x32和Y7x42的构象在二者之间高度一致。且相关的功能实验也表明，在引入DREADD突变后，hM4R针对Gi的本底活性几乎完全丧失。以上结果也很好地解释了，在mAChR家族中，其激动剂多为ACh类似的狭长化学结构的现象 （为了避免破坏稳定的酪氨酸盖结构）（图2）。

相应地，该家族的拮抗剂，包括Clozapine，QNB，Tiotropium等均有较大的环状结构。通过结构比对发现，上述拮抗剂的环状结构会与激活状态受体中的酪氨酸盖有明显的空间位阻。比如，由于QNB与Y3x33侧链的空间位阻，导致了其环状结构朝TM5/6方向的弯曲和偏移，继而使得TM5和TM6在胞外端外移（图2）。而DREADD突变Y3x33C则直接消除了这一位阻影响，让DCZ或CNO的三环结构有足够的空间结合在正位口袋（图2）。该想法也被突变体Y3x33A同样可以被DCZ有效激活的实验结果所证实。而分子动力学模拟实验还揭示了Y3x33可以与ECL2上I45x52等疏水氨基酸相互作用，形成疏水簇，从而进一步稳定酪氨酸盖的构象，促进下方的内源配体及其类似物结合在正位口袋中。该发现也与已经报导的多种mAChR家族的正向别构调节分子 （PAM） 的结合位点位于ECL2和TM6，TM7之间相一致，即通过稳定该部分的构象来帮助下方正构口袋中小分子配体的高效结合。

图2 DREADD系统选择性激活的分子机制

在以上识别模式分析的基础上，结合已发表的结构数据，作者进一步分析，推测认为传统的mAChR家族拮抗剂QNB和Tiotropium可能能够激活DREADD受体。随即的功能实验验证了该想法，作者发现QNB和Tiotropium在BRET2实验中均能够部分激活hM4Di，而不能激活hM3Dq（图3）。在经典的cAMP累积 （针对Gi/Gs偶联受体） 和钙流实验 （针对Gq偶联受体） 中，表现出同样的特征，即QNB和Tiotropium可以完全激活hM4Di，而不能激活hM3Dq。这些数据提示，未来针对QNB或者Tiotropium的改造可以提供有效的亚型选择性的激动配体。而针对其选择性的机制，作者则通过对偶联G蛋白的hM3Dq和hM4Di受体结构的分析，发现相对于hM4Di，hM3Dq的TM6螺旋在激活后会发生更大的外移，提示其激活所需能量可能更高。这一发现，也与几乎所有的激动配体对于hM4Di受体都有相比于hM3Dq更高的效能 （potency） 的现象相一致。

图3 QNB和Tiotropium等mAChR的拮抗剂可以选择性激活hM4Di

综上，该研究深入探索了DREADD系统选择性识别激动配体的分子机制，为开发下一代激动配体提供了结构基础，使得发展化学结构，药理，药代等性质多样化的激动配体成为可能。 此外，尽管Clozapine可以结合众多受体，目前仍未有其结合相关受体的结构被报导，该研究同样也对于了解Clozapine的受体结合模式和药理性质提供了重要帮助。最后，非常欢迎对于神经生物学工具开发，化学遗传操作工具改造，及文章相关内容如有兴趣或疑问，来信与作者交流 （hustzsc@email.unc.edu） 。

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05489-0

制版人：十一

参考文献

1 Armbruster BN, Li X, Pausch MH, Herlitze S, Roth BL. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.Proc Natl Acad Sci U S A2007; 104:5163-5168.

2 Roth BL. DREADDs for Neuroscientists. Neuron 2016; 89:683-694.

3 Sternson SM, Roth BL. Chemogenetic tools to interrogate brain functions.Annu Rev Neurosci2014; 37:387-407.

4 Lee HM, Giguere PM, Roth BL. DREADDs: novel tools for drug discovery and development.Drug Discov Today2014; 19:469-473.

5 Rost BR, Wietek J, Yizhar O, Schmitz D. Optogenetics at the presynapse.Nat Neurosci2022.

6 Wang L, Zhu L, Meister J et al. Use of DREADD Technology to Identify Novel Targets for Antidiabetic Drugs.Annu Rev Pharmacol Toxicol2021; 61:421-440.

7 Gomez JL, Bonaventura J, Lesniak W et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.Science2017; 357:503-507.

8 Roth BL, Sheffler DJ, Kroeze WK. Magic shotguns versus magic bullets: selectively non-selective drugs for mood disorders and schizophrenia.Nat Rev Drug Discov2004; 3:353-359.

9 Chen X, Choo H, Huang XP et al. The first structure-activity relationship studies for designer receptors exclusively activated by designer drugs.ACS Chem Neurosci2015; 6:476-484.

10 Nagai Y, Miyakawa N, Takuwa H et al. Deschloroclozapine, a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys.Nat Neurosci2020; 23:1157-1167.

11 Weston M, Kaserer T, Wu A et al. Olanzapine: A potent agonist at the hM4D(Gi) DREADD amenable to clinical translation of chemogenetics.Sci Adv2019; 5:eaaw1567.

12 Thompson KJ, Khajehali E, Bradley SJ et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo.ACS Pharmacol Transl Sci2018; 1:61-72.

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