编译、撰文 | Qi

CRISPR的故事始于1987年，研究人员发现细菌中存在一段神秘的与病毒中短DNA序列相匹配的DNA重复序列，在这些序列附近还存在CRISPR相关特征基因 （Cas） ，好奇心驱动着科研人员终于展现CRISPR系统如何作为细菌的适应性免疫途径来预防病毒感染。自2012年CRISPR基因编辑技术问世以来，世界各地的科学家们纷纷利用它来探索生物功能、剖析遗传相互作用，并为对抗人类疾病和设计作物的策略提供信息。2020年，诺贝尔化学奖授予了在CRISPR系统研究做出卓越贡献的Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna （BioArt报道：） 。在此十年的重要节点上，来自加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna等人在Science杂志上发表了一篇题为CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning的综述，她们在这篇文章中呈现了十年来CRISPR基因编辑技术的成功，并讨论了当前最紧迫的挑战以及应对这些挑战所做出的的努力，强调了CRISPR在当前以及未来对社会的潜在影响。

1. CRISPR技术的发展

传统的CRISPR-Cas9系统由Cas9核酸酶和工程化的sgRNA组成，后者负责将Cas9引导至靶位点并引起双链DNA断裂 （DSB） ，继而通过非同源末端链接 （NHEJ） 、同源重组修复 （HDR） 等内源性途径对断裂位点进行修复。由于其靶向特异性和高效性，已成功用于构建多种基因敲除动物模型，克服了传统基因打靶方面在编辑和筛选胚胎干细胞方面的诸多不足。CRISPR-Cas9还能用于体细胞编辑，因而允许在更多情况下准确模拟癌症进展和实际的治疗模式，例如酪氨酸血症、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症等模型的开发，使研究人员能够探究特定变异与疾病的因果关系，并开发相应治疗策略。

基于CRISPR介导的基因敲除技术的成熟，以及设计和克隆gRNA的简便性，研究人员已成功将这项技术应用于全基因组的遗传筛选，可以详细研究单个基因破坏如何影响目标细胞以及在合并筛选中对数千个扰动进行高通量测试。CRISPR技术的进步还扩展了其他筛选类型，比如CRISPR干扰 （CRISPRi） 和CRISPR激活 （CRISPRa） 筛选，这些方法目前已经是鉴定癌症相关基因功能的常用方法，可识别各种癌症驱动和调节因素。CRISPR筛选读出的一个令人兴奋的发展领域是提供同步蛋白组学、表观遗传学和转录组学分析的新方法，例如Procode、Perturb-ATAC、Perturb-seq 【BioArt报道：】 和ECCITE-seq。CRISPR筛选和单细胞多组学技术相结合的影响力不止于此，通过进一步改造增加多重CRISPR筛选的潜力有助于揭示新的和复杂的遗传相互作用。

CRISPR-Cas9已适用于同步多位点编辑，这对于编辑可携带多个目标基因拷贝的作物物种如六倍体小麦而言特别有效，在过去十年中，CRISPR-Cas9已成为一种常用的植物编辑工具。其在多重编辑方面的一个优势在于核酸酶和gRNA的分离，这样多个gRNA可以与一个Cas蛋白配合从而编辑不同的目标。另一个重要成果是使用多重编辑来生成内源性逆转录病毒灭活猪，解决了将猪器官移植到人体中的一个主要安全问题。然而，多重编辑中同时发生的DNA切割加剧了哺乳动物细胞中的DSB挑战，即有可能触发由p53控制的DNA损伤反应机制，从而导致细胞衰老或细胞凋亡。随后开发出的base editing和prime editing两项技术不涉及DSB，因而可以应对上述挑战并拓展多重编辑的应用。

Base editing （BE）【BioArt报道：】 主要通过将nCas9或dCas9蛋白与催化碱基脱氨反应的酶融合，sgRNA将融合蛋白导向靶位点进而对单个碱基进行化学修饰，该系统已支持C>T、A>G、C>G、A>I和C>U转换，极大地拓宽了研究人员探究基因内突变影响的能力，并可以通过纠正点突变来治疗遗传疾病。此外，BE可以在分裂细胞和非分裂细胞中引入修饰，相对于仅限于分裂细胞的HDR来说具有优势，消除DSB也是CRISPR实现精准编辑的重要一步。

David Liu团队随后又开发出的Prime editing （PE）【BioArt报道：】 也同样可以在不引入DSB的情况下实现DNA序列的增减。PE由与逆转录酶 （RT） 融合的nCas9和PE向导RNA （pegRNA） 组成，后者既可将nCas9引导至靶位点，又可充当逆转录模板 （其序列携带插入缺失或点突变） 。与BE类似，PE也可以用于纠正非分裂细胞中的突变，但当编辑窗口有多个目标碱基以及PAM序列不紧邻所需编辑位点的情况下，PE更具优势。目前，BE的编辑效率和精确度方面仍然优于PE，因而PE在未来十年的一个主要目标就是在不影响其编辑产品纯度的前提下提高效率。

2. CRISPR面临的挑战

在下一个十年，需要解决几个关键挑战。首先是提高编辑准确性，减少脱靶效应。 截至目前，已陆续开发出多种高保真Cas变体如SpCas9-HF1、evoCas9、HiFiCas9和Cas9_R63A/Q768A等，这些工作时富有成效的，如今临床上使用的CRISPR Therapeutics/Vertex和Intellia sgRNA都没有FAD可检测到的脱靶位点。然而，由于脱氨酶、逆转录酶和转录调节因子等效应域的不依赖于Cas9的行为，也可能导致编辑不准确。此外，提高编辑精确度还需要更好地了解DNA修复过程，最近开发了机器学习工具来预测修复结果，但尚未在体内得到证实，其他方法比如可以提高HDR效率并抑制NHEJ，或控制细胞周期以促进HDR修复等，前面提到的BE和PE也是两种规避DSB的精确编辑策略。需要注意，对于BE而言，旁观者编辑（bystander editing）是相当普遍的现象，在最近对21种不同的BE系统的研究中，大约一半的可靶向致病点突变在编辑窗口中有旁观者，减小编辑窗口的大小可以提高精度，但由于PAM限制，也同时限制了可以定位的基因组位点。目前正在采用包括结构引导诱变、定向进化和计算辅助设计在内的多种策略来增加CRISPR-Cas9的靶向范围并减少BE的旁观者效应。

第二个关键挑战是体内外编辑器的递送，即需要确保高递送效率、目标特异性和安全性。当前的递送策略主要分为体内和体外两种类型，离体方法通常仅限于可以在培养基中存活和扩增并保留功能的细胞类型，如造血干细胞和祖细胞等，体内方法就可以使CRISPR治疗更广泛的遗传疾病，两个显著成功的例子分别是首次使用靶向脂质纳米颗粒（LNP） 递送将CRISPR系统体内递送至肝脏进行转甲状腺素蛋白淀粉样变性的治疗，以及将含有RNA引导酶的腺相关病毒载体直接注射到眼睛中对Leber先天性黑10型进行治疗。然而，许多生物学障碍限制了编辑器在体内的有效递送，比如需要防止货物降解、调理作用和吞噬作用，需要在内吞作用下有效释放货物，并定位到细胞核中染色体的靶位点。

目前哺乳动物系统内的递送方法大致可以分为物理递送 （显微注射和电穿孔） 、基于病毒的递送 （腺相关病毒、腺病毒和慢病毒） 和基于合成材料的递送 （LNP、阳离子聚合物以及金纳米颗粒） 。然而，物理方法仅限于体外递送，几种病毒分别存在低包装容量、免疫原性等问题，而合成材料也具有材料体积大和离子性质的限制，最近细胞外囊泡和病毒样颗粒（VLP） 正在成为有前景的递送方式，有可能实现基于病毒策略的高递送效率，而无需担心病毒基因组整合的安全问题，另外，使用不同的包膜糖蛋白可以编辑VLP的细胞向性以靶向特定细胞类型。

图2. CRISPR面临的挑战及技术革新

3. CRISPR的当前和未来应用方向

目前已至少有8项FDA批准的基于CRISPR的镰状细胞病和相关血液病疗法的临床试验正在进行或即将开展。除了临床应用，CRISPR对农业和畜牧业也产生重要影响，例如营养价值更高的番茄和两种经过编辑的鱼已获批在日本销售，通过多重编辑敲除和激活不同基因在小麦种引入抗病性并提高产量等。未来十年，基因组编辑研究和应用将继续加速，并将越来越多地与机器学习、活细胞成像和DNA测序等技术实现交叉。CRISPR作为一项由好奇心驱动的研究、创新和技术突破间联系的成功例子，鼓励我们继续探索自然世界，将可能发现更多无法想象的事物，并将其用于解决现实世界中的难题。

https://doi.org/10.1126/science.add8643