第一次做流式，最崩溃的不是上机，是上完机拿到那堆密密麻麻的散点图。细胞碎片、死细胞、粘连体混在一起，根本分不清。导师丢下一句「你回去圈个门」，我对着屏幕愣了半天 —— 门在哪儿？
后来被师兄按着头画了十几管样本，才终于搞明白：圈门不是艺术创作，是一套固定到有点死板的排除逻辑。顺序对了，谁画都一样。
今天就用人外周血分 T 细胞、B 细胞的真实流程，把每一步在电脑上怎么点、画什么形状、排除什么，完完整整走一遍。新手直接照着做就行：
先别急着画门，看懂两张图
流式所有圈门，第一步全都要看 FSC 和 SSC。不用背原理，记住两句话：
FSC：只看细胞大小，细胞个头越大，数值越高；
SSC：只看细胞内部结构，细胞内部越复杂（颗粒多），数值越高。
例如：正常人外周血白细胞，在 FSC/SSC 散点图上自然分成三堆，位置非常固定：
左下角：淋巴细胞（个头小、结构简单）
中间偏上：单核细胞（个头中等、结构中等）
右上角：粒细胞（个头最大、颗粒最多）
图 1：外周血三群典型位置，记牢这个图，后面所有操作都从这里出发
（源自腾讯网视频）
做好对照，圈门才不会瞎画
很多人结果不准、重复性差，不是因为不会画门，而是没调对照就上样本。这三类对照，上机前必须调好，不然你圈出来的群可能是假的：
空白对照（未染色细胞）：定出阴性基线，分清「真信号」和「背景噪音」
同型对照：排除抗体非特异性结合，避免假阳性
单染管对照：调荧光补偿，解决光谱重叠串色
图 2：对照调好的样子，阴性和阳性分得清清楚楚
（源于毕合生物）
六步圈门流程：在电脑上一步一步点出来
案例：人外周血，裂红后染色（CD3-FITC 标记 T 细胞，CD19-APC 标记 B 细胞，7-AAD 死活染料）。
目标：统计样本中 T 细胞、B 细胞的真实占比。
图 3. 源自 BD Biosciences
第 1 步：先筛出完整、有效的细胞，剔除所有碎片
调取散点图：FSC-A vs SSC-A。直接手动画一个大多边形门，把中间形态完整、轮廓正常的完整细胞全部圈进去。左下角零散、信号又弱又碎的小点，全是细胞碎片和杂质，直接排除，不要圈入门内。
图 4：源自丁香园
第 2 步：去掉细胞粘连体（连体婴）
调取散点图：FSC-H vs FSC-A，只针对第一步圈好的细胞群单独分析。正常单个细胞，信号面积和信号高度比例均匀，会整齐沿着对角线排布。两个或多个细胞粘在一起的粘连体，会明显偏离对角线。直接画椭圆门圈住对角线整齐细胞群，门外全部粘连杂体直接剔除。
图 5：源自菲恩生物
图 6：源自赛尔普生物
第 3 步：精准筛出活细胞
调取散点图：SSC-A vs 7-AAD 死活染料，仅对上一步合格单细胞分析。死细胞细胞膜破损，7-AAD 染料能钻进细胞结合核酸，荧光信号会特别强；活细胞不会结合染料，荧光完全阴性。直接圈出 7-AAD 阴性细胞群，留下来的是高活性合格细胞。
图 7：活细胞在阴性区，死细胞跑到右边去了
（源自 Cell Signaling）
第 4 步（可选，但样本杂质多时必做）：纯化免疫细胞
调取散点图 SSC-A vs CD45（白细胞通用标记）。直接圈出 CD45 阳性细胞群，把残留的少量红细胞、破碎杂质、非白细胞全部筛掉，后续分群背景会更干净，数据更稳。
图 8：CD45 阳性门内才是真正的白细胞
（源自厦泰生物）
如果你的样本杂质多、背景脏，这一步能让你后面的分群干净一大截。
第 5 步：核心荧光分群，精准区分 T 细胞 vs B 细胞
调取散点图：CD3-FITC vs CD19-APC，只在前面筛选好的活细胞里分析，直接用经典四象限门划分亚群：
左上象限：CD3 阳性、CD19 阴性 —— 功能性 T 细胞。
右下象限：CD3 阴性、CD19 阳性 —— 功能性 B 细胞。
左下象限：双阴性细胞，主要是单核细胞、NK 细胞等其他免疫细胞。
右上象限：双阳性细胞，正常外周血里数量极少，基本可以忽略
图 9：源自知乎
看到 T、B 清清楚楚分开在四个象限里，前面所有脏活累活就都值了。
第 6 步：导出数据，收工
圈门全部确认无误后，直接读取门内细胞占比，就能得到真实可用的实验数据，这样数据干净、重复性高，后续复测误差也很小。
图 10：圈门确认无误后直接读比例
（源自于 Elanscience）
重复实验小技巧：保存好门的位置，下次直接调用，不要凭感觉重新画，否则误差很大。
三条不废话的实操原则（血泪总结）
1. 顺序不能乱
碎片 → 单细胞 → 活细胞 → 亚群
每一步只在上一步合格的门内操作，不可逆、不许跳步。
2. 不看对照不画门
基线、补偿全部用对照管调好。门画在阴性边界上，不要凭肉眼主观往右挪。挪一次，数据就不敢信了。
3. 门形跟着细胞群轮廓走
常规免疫细胞用多边形或椭圆门，贴合细胞群边缘。遇到稀有细胞或弱表达，切换密度图或等高线图，边界看得更清楚，圈得更准。
这套思路还能用在哪？
你学会了上面这套分层排除法，不只是 T、B 细胞，绝大多数流式实验都能直接套用：
免疫分型：CD4 / CD8 T 细胞亚群、Th1/Th2、单核细胞分群（CD14、CD16）
细胞凋亡：Annexin V / PI 双染，区分活、早期凋亡、晚期凋亡、坏死
细胞周期：PI 染色，圈 G0/G1、S、G2/M
通用公式：圈出主细胞群 → 圈出单细胞 → 圈出活细胞 → 用特异标记圈出目标细胞
图 11：整个圈门逻辑的总结图，看一眼就记住
（源自知乎）
第一次画门，你可能还是会手忙脚乱。没关系，照着上面的六步，一步一个图，画完一遍之后，你会发现：
那些杂乱无章的散点图，其实一直都有规律。
保存好你的门模板，下次做重复实验，直接调用。
这样出来的数据，你自己敢信，审稿人也挑不出毛病。
编辑：冷漠小 z
题图：自制
热门跟贴