过敏性疾病被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一，是世界上最常见的慢性疾病之一 。肥大细胞是过敏反应中的重要效应细胞，大量存在于机体屏障组织中，如皮肤、呼吸道和胃肠道黏膜。转录组测序（RNA-seq）技术是通过反转录从RNA中获得互补DNA序列的高通量测序技术。RNA-seq是近年来转录组学中应用最广泛的技术之一，它可以揭示遗传改变与复杂生物学过程之间的关系 。
集美大学海洋食品与生物工程学院，福建省海洋功能食品工程技术研究中心的刘 艳，谷福蝶，刘庆梅* 等以IgE介导的RBL-2H3细胞为过敏反应模型，通过RNA-seq技术对RBL-2H3细胞激活后表达差异显著的基因及其参与的信号通路进行分析，以期为IgE介导的过敏反应潜在靶点提供参考。
01
RBL-2H3 细胞激活模型的建立
结果如图1A、B所示，在DNPBSA质量浓度低于500 ng/mL时，β-氨基己糖苷酶释放率以及组胺释放量与DNP-BSA质量浓度呈正相关趋势。DNP-BSA终质量浓度1 000 ng/mL与DNP-BSA终质量浓度500 ng/mL相比，β-氨基己糖苷酶的释放有显著差异，但组胺释放差异不显著，说明当使用500 ng/mL DNP-BSA后，RBL-2H3的激活已基本饱和，从成本的角度考虑，最终确定DNP-BSA的最适质量浓度为500 ng/mL。此外，过敏反应发生后，效应细胞不仅脱颗粒和释放组胺等过敏介质，也会分泌大量的细胞因子（TNF-α及IL-4）诱发炎症反应，使用500 ng/mL DNP-BSA构建IgE介导的RBL-2H3细胞激活模型，测定TNF-α以及IL-4的分泌情况，结果如图1C所示，TNF-α产生量从120.08 pg/mL增加到253.69 pg/mL，IL-4的释放量从15.77 pg/mL增加到77.32 pg/mL，结果表明当RBL-2H3细胞被激活时炎症因子明显增多，说明500 ng/mL DNP-BSA刺激RBL-2H3后，细胞发生了强过敏反应，过敏介质及相关细胞因子均显著上调，模型构建成功。该过敏反应细胞模型的构建能够为效应细胞激活的分子机制探究奠定基础，也可用于抑制过敏反应的天然产物或药物的筛选及机理分析。本课题组也利用该模型对海洋的天然活性物质的抗过敏活性进行了初筛，并且使用该模型对筛选出的活性物质以及红藻中提取的多糖等进行了抗过敏机理的研究。
02
DEGs RNA-seq数据质量分析
据表1结果可知，样品中Q20均高于98%，Q30均高于94%（Q20、Q30分别指测序质量在99%和99.9%以上的碱基占总碱基的百分比，一般Q20在85%以上，Q30在80%以上），这一结果表明测序的6个样本clean reads质量良好，没有存在污染的情况，能够达到RNA-seq的要求，可以用于后续分析。
03
DEGs表达水平分析
为了探究RBL-2H3细胞激活前后基因表达水平的数量以及动态变化，通过每百万次读取的转录本进行了不同样品间的DEGs分析。得到有关阳性组和阴性组样品之间DEGs的Venn图（图2A），其中检测到10 880个DEGs共同表达，而在阳性组中特异表达的DEGs有199个，阴性组特异表达的DEGs有185个。为进一步了解RBL-2H3细胞激活前后DEGs的差异变化，利用DESeq2软件分析获得两组间发生差异表达的基因，结果如图2B、C所示，共有232个DEGs，其中表达量显著下调的基因18个，表达显著上调的基因214个。由此可见，RBL-2H3细胞激活主要体现在DEGs的上调表达，如Tnfaip3、Tnfsf8、Fos等，RBL-2H3细胞的激活会发生细胞脱颗粒，产生大量的包括TNF-α在内的炎症因子，在一定程度上说明了显著上调的DEGs与炎症因子的产生有必然关系。在其他研究中，也发现效应细胞激活会导致信号通路下游蛋白迅速磷酸化从而释放炎症因子。
04
DEGs的生物学功能分析
1、DEGs的GO功能分类统计
图3为GO分析中DEGs参与的生物学过程。涉及生物过程、细胞组分和分子功能，其中归属于生物过程的最多（25个），主要集中在细胞过程、生物调节和生物过程调节等；涉及细胞组分有14个生物学过程，主要集中在细胞部分、细胞和细胞器；分子功能富集到的生物学过程有11个，主要集中在结合。
2、DEGs表达水平分析DEGs的EggNOG功能注释
将DEGs注释到EggNOG数据库，并对DEGs的功能进行分类。由图4可知，有127个DEGs注释到EggNOG数据库，占总DEGs的54.74%，注释后的DEGs分配至13 类功能中，在不同的功能分类存在明显差异，其中细胞内运输、分泌和囊泡运输（占比最多（15.95%），其次是翻译后修饰、蛋白质折叠和分子伴侣占比9.48%，而转录占比7.76%，其余基因功能注释数目占比均在5%以下。根据注释结果得知RBL-2H3细胞激活后，转录因子细胞内运输、分泌和囊泡运输活跃，转录因子在细胞核中与DNA进行结合，使得胞内炎症介质等迅速生成与释放。
05
DEGs的KEGG信号通路分析
1、DEGs的KEGG通路富集分析
为探寻DEGs参与的主要信号转导和生化代谢途径，进行KEGG通路富集分析，图5展示了部分信号通路，其中改变较为明显的KEGG通路为TNF信号通路、Janus激酶-信号转导与转录激活子（Jak-STAT）信号通路、MAPK信号通路以及Toll样受体（TLR）信号通路等。根据富集结果可以发现，效应细胞激活作用能够提高MAP3K8、Junb、Nfkbia、Jun、Fos等基因表达水平，促进TNF信号通路及下游基因表达（图5、表2），这可能是RBL-2H3细胞激活后释放炎症因子的重要原因之一。
2、DEGs的主要信号通路分析
MAPK信号通路（图6A）、Jak-STAT信号通路（图6B）、TNF信号通路（图6C）以及TLR信号通路（图6D）4 条信号通路的DEGs在阳性组和阴性组之间均显示不同的表达量，与阴性组对比，阳性组的基因表达均有所上调。MAPK是炎症反应中的典型下游信号通路 ，TNF- α 在激活的RBL-2H3细胞中能检测到明显升高 。当RBL-2H3细胞被激活时，MAPK等信号通路的信号分子发生磷酸化，炎症因子得以产生并释放，这些信号通路是过敏反应中效应细胞激活的关键因素，相关信号分子有望成为抑制过敏反应的关键靶点。 通过本研究转录组信息分析和前人的相关研究，能够得知MAPK、Jak-STAT、TNF以及TLR信号通路在过敏反应效应细胞的激活中起到了重要作用，相关信号分子有望作为防治过敏性疾病的潜在靶点。
3、DEGs的TNF信号通路图
针对TNF信号通路，绘制具体的信号传导机制图，如图7所示，DNP-BSA能激活TNF信号通路，大致过程为在炎症反应中当TNF与其受体TNFR1结合后，通过招募TRAF2/5连接蛋白诱导下游的 NIK 等基因活化，使得转录因子AP-1产生量增加，而AP-1会进入细胞核，与DNA结合，促进TNF等炎症因子的释放量增加，进而产生严重的过敏反应。有研究表明TNF是关键的炎症调节因子，其通过激活2个主要信号通路，即NF- κB 和MAPK实现其生物学功能 ，对于过敏反应及炎症反应都相当重要。 这说明可以将TNF信号通路作为治疗过敏性疾病潜在的靶点。
结 论
利用RNA-seq手段结合GO、KEGG数据库对IgE介导的RBL-2H3细胞体外过敏模型进行转录组学分析，IgE介导的RBL-2H3细胞激活后，转录水平上体现出多数基因的上调表达，共筛选得到232个表达量有显著差异的基因，其中显著上调基因214个，而显著下调的基因仅有18个；此外，DEGs的KEGG富集分析显示，RBL-2H3细胞激活参与调控的主要为TNF、MAPK和Jak-STAT等信号通路，其中TNF信号通路富集的DEGs数量最多。虽然本研究找到一些重要的转录因子，如MAP3K8、Junb、Nfkbia、Jun、Fos等，仍然缺乏足够的研究可以阐述过敏反应和这些转录因子之间的直接关系，这需要今后深入研究。本研究探讨了RBL-2H3细胞激活的分子机制，挖掘了过敏反应效应细胞激活的重要信号通路，为IgE介导的过敏反应的防控研究提供理论依据。
本文《基于RBL-2H3模型分析过敏反应效应细胞激活的差异基因》来源于《食品科学》2022年43卷22期105-112页，作者：刘 艳，谷福蝶，陈慧莹，李 焱，周 钰，张 军，刘 红，曹敏杰，刘光明，刘庆梅*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211223-265。点击下方 阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
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