Introduction
硫酸多糖是广泛存在于海藻中的结构成分，在食品工业中被广泛用作凝胶剂（琼脂）和增稠剂（卡拉胶）。它们还具有有用的生物活性，如降血脂、抗氧化和益生元活性。坛紫菜是一种经济上重要的大型红色海藻，在中国沿海广泛种植，尤其是在福建和浙江省。坛紫菜硫酸多糖主要由半乳糖和3,6-脱水半乳糖组成。近年来，坛紫菜多糖（PHP）以其降血脂、抗氧化和抗凝等生物活性日益受到人们的关注，其在功能性食品中的应用潜力巨大。
肠道微生群落对人类健康有重要影响，具有许多功能，如帮助维持上皮屏障、调节和成熟免疫系统以及产生各种有益健康的代谢产物。未消化的多糖被结肠内的肠道菌群发酵和利用，调节肠道菌群的组成，增加短链脂肪酸（SCFA）的产生。SCFA是一种含有1到6个碳原子的脂肪酸，而乙酸、丙酸和丁酸是肠腔中主要的SCFA。由特定多糖种类产生的不同SCFA之间的分布与其单糖组成、糖苷键、链分支和构象以及表面形貌有关。因此，确定多糖的结构和链构象有助于了解其构效关系。一种从褐藻中提取得到的多糖具有益生作用，并提高SCFA的产量。同样，一种从红藻中提取得到的多糖也具有益生作用，并促进SCFA的产生。有研究表明坛紫菜粗多糖可以调节微生物组成并促进SCFA的产生。迄今为止，还没有报道纯化的坛紫菜多糖对肠道菌群的调节，以及它们的结构与肠道菌群组成调节之间的关系。本研究假设从坛紫菜中分离的多糖组分（PHP2）具有调节肠道微生物的作用。
福建农林大学陈培琳博士和曾红亮副教授等 研究坛紫菜多糖组分（PHP2）的结构和发酵特性。通过FT-IR、甲基化分析、NMR和原子力显微镜（AFM）对其结构进行了表征。分别用16srrna基因测序扩增和气相色谱法（GC）来评估微生物组成和SCFA产生的变化。
Results and Discussion
PHP2的化学组成
PHP2的总糖含量为93%，蛋白质含量为0.53%（表1），硫酸盐含量为5.07%（均以重量百分比计）。PHP2主要由半乳糖（69.27%）、甘露糖（21.32%）和葡萄糖（9.41%）组成（图1A，表1）。
图1 （A）通过GC测定的PHP2单糖组成；（B）PHP2的FT-IR光谱；（C）GC-MS总离子色谱图
表1 PHP2的化学结构组成
红外光谱分析
PHP2的红外光谱如图1B所示，3436 cm -1 处的强宽峰和2928 cm-1处的弱峰归因于O–H拉伸振动和C–H弯曲振动，1637 cm-1处的峰值为H–O–H弯曲振动，1417 cm-1处的峰值表现为C=O的拉伸振动，1384 cm-1处的峰值对应于硫酸根的拉伸振动，1254 cm-1处的峰归因于硫酸根基团的S=O拉伸振动，在1200-1000 cm-1范围内有三个峰（1155、1073和1035 cm-1）是吡喃糖单糖环的特征吸收峰，773 cm-1处的弱吸收峰为吡喃糖环的骨架弯曲振动。990 cm-1处的峰值归因于C–O的拉伸振动，933 cm-1处的吸收峰是3,6-内醚键的C–O伸缩振动，894 cm-1处的吸收峰为β键的C–O–C振动，而817 cm-1处的吸收峰归因于α构型和C–O–S拉伸振动，617和580 cm-1处的峰值归因于O=S=O的弯曲振动。
甲基化分析
PHP2的GC-MS总离子图如图1C所示。PHP2的峰被确定为2,3,4,6-四甲基-甘露糖残基（2,3,4,6-Me 4 -Manp）、2,3,6-三甲基-半乳糖残基（2,3,6-Me 3 -Galp）、2,3,4-三甲基-半乳糖残基（2,3,4-Me 3 -Galp）和2,3-二甲基-葡萄糖残基（2,3-Me 2 -Glcp）（表2），说明PHP2的糖苷键分别为Manp-(1→、→4)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→和→4,6)-Glcp-(1→，这与单糖组成的结果一致。2,3,4,6-Me 4 -Manp残基表明PHP2包含一条侧链。
表2 PHP2甲基化分析
核磁共振分析
PHP2的 1 H-和 13 C-NMR如图2A和2B所示，从图中可以得出，共有四个异头质子（δ 5.20、5.07、4.77和4.64）和四个异头碳，包括δ 103.08、101.80、101.02和97.99。δ 5.20的化学位移归属于甘露糖（Man）的H1，δ 5.07的化学位移是半乳糖（Gα）的特征信号，δ 4.77的化学位移是葡萄糖（Glc）的特征信号，δ 4.64下的化学位移是D-半乳糖-4-硫酸根（G4Sβ）的特征信号。
（A）1H谱；（B）13C谱。
图2 PHP2的一维核磁共振谱
异头碳和异头质子之间的相关性在HSQC光谱中找到归属。HSQC（图3A）光谱中δ 103.08/4.64、101.80/4.77、101.02/5.20和97.99/5.07处出现的化学位移分别归属于G4Sβ、Glc、Man和G的H1/C1。G4Sβ的其他质子信号从COSY（图3B）、TOCSY（图3C）和NOESY光谱（图3D）找到归属，H2-H5的化学位移分别为δ 3.66、4.38、4.22、3.89和3.91（表2），从HSQC光谱中获得残基G4Sβ碳的归属，C2-C5的相应碳信号分别为δ 80.71、79.54、78.46、67.33和61.04。根据COSY（图3B）、TOCSY（图3C）和NOESY（图3D）光谱中的相邻相关性以及HSQC光谱中相应的碳信号，残基Glc的H2/C2、H3/C3、H4/C4、H5/C5和H6/C6分别为δ 3.52/72.05、3.73/70.33、3.65/75.69、3.88/67.36、3.80/69.14。从COSY（图3B）、TOCSY（图3C）和NOESY（图3D）光谱获得了残基Man和残基Gα的完整质子化学位移，并通过HSQC（图3A）光谱中找到了相应的碳信号，具体的化学位移如表3所示。
根据HMBC光谱中相关信号值确定PHP2残基之间的糖苷键连接顺序。从图3E中可知，在δ 4.77/82.86处的信号值为Glc（H1）和Gα（C4）的信号，表明Glc通过1→4糖苷键与Gα相连。同样，在δ 4.64/75.69（G4Sβ（H1）/C4（Glc））、δ 5.07/61.04（G4Sβ（C6）Gα/（H1））和δ 5.20/69.14（Man（H1）/Glc（C6））处的交叉峰表明，G4Sβ通过1→4糖苷键与Glc相连，Gα通过1→6糖苷键与G4Sβ相连，Man通过1→6糖苷键与Glc相连。因此，结合FT-IR、单糖组成、甲基化和NMR分析，PHP2被鉴定为一种新型的硫酸葡萄糖半乳聚糖，并且推测可能的结构单元为→4)Gα(1→6)G4Sβ(1→4)Glc(1→4和侧链Man(1→6)Glc，PHP2可能的化学结构单元如图3F所示，结合PHP2的分子量，重复的结构单元数约为1530个。
（A）1H/1H COSY；（B）1H/1H NOESY；（C）1H/1H TOCSY；（D）1H/13C HSQC；（E）1H/13C HMBC；（F）PHP2的可能化学结构单元。
图3 PHP2的二维核磁共振谱
表3 1H and 13C NMR 化学位移
AFM分析
PHP2的链特征、宽度和高度由平面图像确定（图4A），PHP2具有不规则的球形链构象，大小均匀。NanoScope分析软件计算发现，最大聚集体的长度和宽度分别为0.142和0.083 μm，该聚集体的高度约为7.4～9.1 nm，高于单个多糖的高度（0.1～1 nm）。这可能与PHP1.0-1-UF的羟基、硫酸盐基团和支链结构有关，这些结构更易于多糖分子之间发生相互作用。PHP1.0-1-UF的3D AFM扫描图如图4B所示，PHP1.0-1-UF并不是完全的球形链构象，而更像“地形图”。
（A）二维图像；（B）3D图像。
图4 原子力显微镜图像
PHP2对大鼠粪便菌群组成的影响
多样性分析
α-多样性是衡量肠道微生物区系丰富度（Chao指数）和多样性（Shannon和Simpson指数）的成熟指标。Chao指数（图5A）表明，与PB相比，PHP2处理增加了微生物丰富度（P<0.05）。PHP2处理后的Shannon指数显著低于PB，而相反，PB的Simpson指数显著低于PHP2。为了研究不同样品的微生物组成之间的相似性或差异，对样品微生物区系距离矩阵进行了聚类分析，并构建了层次聚类树（图5D）。这揭示了PB和PHP2处理的微生物区系之间的显著差异，并且在INU和PHP2处理之间也观察到了明显的分离。使用主成分分析（PCA）显示β-多样性，这是为了可视化不同培养物中微生物区系之间的差异（图5E）。PC1和PC2分别占变异的97.85%和2.14%。不同的培养样品被很好地分离，但每个培养物的复制品被紧密地分组。β-多样性计算表明，PHP2培养物的微生物组成与INU和PB的微生物组成显著分离。
（A）Chao指数；（B）Shannon指数；（C）Simpson指数；（D）层次聚类树；（E）主成分分析。
图5 比较PHP2、菊糖（INU）和母液（PB）发酵过程中微生物成分的变化
关键微生物分析
为了说明PHP2对肠道微生物区系的修饰，确定了属水平上的微生物分布（图6A）。与Lactobacillus属占微生物种群95%以上的PB相比，用INU和PHP2发酵从根本上改变了分布，Escherichia-Shigella占种群的90%以上。Escherichia-Shigella和Lactobacillus的相对丰富性使得在属水平细菌分类图谱中几乎无法检测到其他属。根据我们之前的研究，PHP2的分子量为（1.14 × 10 6 （±3.44%）g/mol。Escherichia-Shigella的增加可能与碳水化合物水解酶将PHP2降解为低聚糖有关。低分子量碳源可以被Escherichia-Shigella降解，但多糖不能。然而，在相关热图中，不同培养基之间的微生物组成存在细微差异（图6B）。与PB相比，PHP2中Escherichia-Shigella、Ruminococcaceae_UCG-005、Ruminococcus_2、Lactococcus和Candidatus_Saccharimonas的相对丰度增加，而Enterococcus、Prevotella_9、Dubosiella、Coriobacteriaceae_UCG-002、Parabacteroides, Adlercreutzia、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Bacteroides、Helicobacter和norank_o__Gastranaerophilales减少。与INU相比，在PHP2中，Ruminococcaceae_UCG-005、Prevotella_9、Ruminococcus_2、Fusicatenibacter、Phascolarctobacterium、Lactococcus、Desulfovibrio、Candidatus_Saccharimonas、Prevotellaceae_Ga6A1_group、和norank_f__Eggerthellaceae的相对丰度增加，而Enterococcus、Kosakonia和Adlercreutzia相对丰度下降。Ruminococcaceae_UCG-005和Ruminococcus_2属于厚壁菌门，它们具有很高的降解多糖的能力。Prevotella_9丰度的降低可能是由于相对缺乏降解PHP2的编码基因。可引发炎症、导致多种疾病的Helicobacter数量减少，表明PHP2抑制了其生长。含PHP2的Desulfovibrio丰度的增加可能与PHP2的硫酸化有关，因为脱Desulfovibrio是一种硫酸盐还原菌。
图6 （A）微生物属相对丰度的叠层柱状图；（B）前50个属相对丰度的热图分析；（C）乙酸、丙酸和丁酸的浓度；（D）SCFA生产和发酵之间的相关热图；（E）最丰富的50个属的相关热图
关键微生物与SCFA之间的相关性
在体外厌氧发酵过程中产生的SCFA主要是乙酸、丙酸和丁酸（图6C）。发酵24 h后，这些SCFA在INU和PHP2发酵中显着增加（P<0.05），与PB相比增加了约10～15倍。INU中丙酸含量显着高于PHP2（P<0.05）。为了评估PHP2对微生物组成和SCFA产生之间关系的影响，进行了相关性分析（图6D）。Streptococcus、Prevotellaceae_NK3B31_group、Parabacteroides、Lactobacillus、Faecalibaculum、Dubosiella、Desulfovibrio、Coriobacteriaceae_UCG-002、Christensenellaceae_R-7_group和Aerococcus与乙酸、丙酸和丁酸水平呈负相关（P<0.05）。Norank_f__Muribaculaceae与乙酸呈负相关（P<0.05）。Helicobacter与丁酸呈负相关（P<0.05），说明丁酸抑制幽门螺杆菌的生长。Allobaculum与丙酸和丁酸呈负相关（P<0.05）。Escherichia-Shigella与乙酸、丙酸和丁酸呈正相关（P<0.05）。根据物种相关热图（图6E），微生物分布不仅受碳源和SCFA水平的影响，而且各属也部分相互拮抗。Escherichia-Shigella与Lactobacillus、Prevotella_9、Dubosiella、Coriobacteriaceae_UCG-002、Helicobacter和Adlercreutzia呈负相关。Lactobacillu与Ruminococcaceae_UCG-005、Ruminococcus_2和Lactococcus呈负相关，但与Enterococcus、Prevotella_9、Dubosiella、Coriobacteriaceae_UCG-002、Helicobacter和Adlercreutzia呈正相关。SCFA的产生受单糖组成、糖苷键、链分支和多糖构象的影响。PHP2由半乳糖和葡萄糖组成，具有单残基甘露糖侧链。由半乳糖和甘露糖组成的瓜尔豆胶也促进了SCFA的产生。PHP2的链构象为不规则球形且大小均匀。这将为微生物多糖降解酶提供更容易的途径。
代谢功能预测
涉及碳水化合物、氨基酸和脂质代谢的微生物代谢途径的预测功能热图，包括43条KEGG途径（基于PICRUST 2对群落进行的系统发育调查，图7）。INU和PHP2的代谢途径非常相似，但明显不同于PB。PHP2处理后，与碳水化合物代谢相关的代谢途径（包括淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、糖酵解/糖异生、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和肌醇磷酸酯代谢）的代谢通量均降低。观察到的微生物果糖、甘露糖和半乳糖代谢的减少可能与微生物群耗尽PHP2的甘露糖和半乳糖含量有关。相反，经过PHP2处理后，丙酮酸代谢、丁酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丙酸代谢、柠檬酸循环、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、C5分支二元酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢的途径流量增加。PHP2处理后，赖氨酸生物合成、酪氨酸代谢、赖氨酸降解和色氨酸代谢等氨基酸代谢降低，而甘油磷脂代谢和脂肪酸生物合成增加。随着PHP2的增加，甘油脂质代谢、脂肪酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、鞘脂代谢、次级胆汁酸生物合成、酮体的合成和降解以及初级胆汁酸生物合成也减少。丁酸和丙酸代谢的增加似乎与PHP2处理产生的丙酸和丁酸的增加以及微生物将其用作能源有关。
图7 PHP2、INU和PB对与氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢相关的KEGG通路调节热图
Conclusion
从坛紫菜中提取纯化了一种新的硫酸化葡萄糖半乳聚糖（PHP2）。PHP2主要由半乳糖、甘露糖和葡萄糖组成。PHP2具有羟基、硫酸基和分支结构。提出了PHP2的假设结构，包括主干结构：→4)Gα(1→6)G4Sβ(1→4)Glc(1→4和侧链Man(1→6)Glc。PHP2具有不规则的球形链构象。PHP2促进了大鼠粪便微生物区系中SCFA的产生，并影响了微生物代谢途径的通量分布。对代谢功能的预测表明，PHP2可能能够调节胆固醇代谢，并提供其他有益于健康的作用。大鼠粪便微生物群降解PHP2的一个可能机制是通过Desulfovibrio（去除硫酸盐）、Ruminococcaceae_UCG-005和Ruminococcus_2（多糖链降解）进行初始降解，然后由其他属（如Phascolarctobacterium、Escherichia-Shigella和Prevotella_9）代谢单糖和低聚糖。目前的研究表明，除了与硫酸多糖相关的功能性食品外，PHP2作为益生元功能性食品成分似乎还有相当大的潜力。
第一作者
陈培琳，工学博士，主要研究方向：功能性碳水化合物结构表征、功能性碳水化合物活性、功能性碳水化合物与肠道菌群相互作用。目前共发表学术论文：18篇，其中第一作者9篇，以第一作者在Food Research International、International Journal of Biological Macromolecules、Food Science and Human Wellness等国际期刊发表SCI论文7篇，参与国家自然青年科学基金1项。
通信作者
曾红亮，博士，副教授，博士生导师，福建农林大学食品科学与营养健康研究院副院长，福建省食品添加剂和配料工业协会会长。福建省杰出青年基金获得者，福建省高校领军青年拔尖人才，福建省高校新世纪优秀人才支持计划人选，第五届福州青年科技奖获得者，爱尔兰农业部农业与食品发展局访问学者，《食品工业科技》首届青年编委。
长期从事食品加工技术、食品营养与肠道菌群、海洋生物资源开发与综合利用等领域的研究工作，主持国家自然科学基金、福建省自然科学基金杰出青年、福建省区域发展重大项目等10余项，主持和参与完成10项成果，获福建省科技进步一等奖1项（第二完成人）、二等奖1项（第一完成人）；以第一作者或通讯作者发表论文70余篇，其中SCI/EI收录50余篇；获国家发明专利授权15件，参编教材/专著2部，担任《Trends in Food Science & Technology》、《Gut Microbes》、《Critical reviews in food science and nutrition》、《Food Chemistry》、《Carbohydrate Polymers》、《Journal of Agricultural and Food Chemistry》、《现代食品科技》等多个高水平期刊审稿人。
Structure elucidation and in vitro rat intestinal fermentation properties of a novel sulfated glucogalactan from Porphyra haitanensis
Peilin Chena,b, Lu Liub, Zirun Chengb, Yi Zhanga,b,c, Baodong Zhenga,b,c, Xiaoke Hud,*, Hongliang Zenga,b,c,*
a Engineering Research Center of Fujian-Taiwan Special Marine Food Processing and Nutrition, Ministry of Education, Fuzhou 350002, China
b College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
c Fujian Provincial Key Laboratory of Quality Science and Processing Technology in Special Starch, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
d Key Laboratory of Coastal Biology and Bioresource Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China
*Corresponding author.
Abstract
This study was to investigate the structure and rat fecal microbial fermentation properties of a polysaccharide fraction (PHP2) isolated from the red marine alga Porphyra haitanensis. PHP2 was characterized as a sulfated glucogalactan, with a hypothetical backbone structure of →4)Gα(1→6)G4Sβ(1→4)Glc(1→ and a side chain of Man(1→6)Glc. PHP2 had an irregular spherical chain conformation. The 16S rRNA sequence analysis revealed that PHP2 modulated the rat fecal micro-flora composition, with a similar effect to inulin, changing the dominant genus (Lactobacillus and Escherichia-Shigella) and promoting the growth of organisms that degrade sulfur-containing polysaccharides, such as Desulfovibrio, Ruminococcaceae_UCG-005, and Ruminococcus_2. PHP2 can promote production of acetic, propionic and butyric acid by rat fecal micro-flora. Prediction of metabolic function suggested that PHP2 could modulate cholesterol metabolism. The sulfated glucogalactan fermentation behavior may be associated with its monosaccharide composition, chain branching and chain conformation. PHP2 appeared to have considerable potential as functional food, and was associated with sulfur-containing polysaccharides in general.
Reference:
CHEN P L, LIU L, CHENG Z R, et al. Structure elucidation and in vitro rat intestinal fermentation properties of a novel sulfated glucogalactan from Porphyra haitanensis[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2): 596-606. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.062.
文章编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
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