布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂 (PRN-473) 在治疗犬落叶型天疱疮中的疗效|介导|受体|布鲁顿|抗体|犬落叶型天疱疮|血清|酪氨酸激酶抑制剂

投稿作者：许晓鸥

作者：Elizabeth C. Goodale, Katarina E. Varjonen, Catherine A. Outerbridge, Petra Bizikova ,Dori Borjesson, Dedee F. Murrell, Angelina Bisconte, Michelle Francesco, Ronald J. Hill, Mohammad Masjedizadeh, Philip Nunn, Steven G. Gourlay and Stephen D. White.

翻译：许晓鸥

校对：辛蕾

背景：布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)在B细胞信号转导中很重要。已报告BTK抑制剂(BTKi)在人类自体免疫性疾病中的疗效。犬落叶型天疱疮(cPF)是最常见的犬自体免疫性皮肤病。

目的：确定BTKi在cPF治疗中的安全性和疗效。

动物：9只家养犬。

方法和材料：对诊断为PF的9只犬给予BTKi PRN473。初始剂量为≈15mg/kg，每日一次，如果治疗疗效不佳，则增加至每日两次。治疗最长持续20周，并尝试减量为隔日一次。通过全血细胞计数、血清生化全套、尿液分析对犬进行监测，并使用经过验证的人类天疱疮疾病活动指数(cPDAI)的改良版本进行评估。在治疗期前后进行抗桥粒糖蛋白-1(DSC-1)和桥粒芯糖蛋白-1(DSG-1)免疫球蛋白G(IgG)滴度测定。在外周血单核细胞中测定与靶点结合的药物。

结果—在治疗的前两周，所有的犬（9只）均出现了病变区域的减少和cPDAI评分的降低。在研究结束时判断疗效，有4例“良好”，2例“一般”，2例“较差”，1只犬因曾切除的肥大细胞瘤复发而退出研究。4只犬达到4周的持续改善；3只犬到研究结束时接近完全缓解。3只犬中的抗DSC-1 IgG滴度降低，2只犬中的抗DSC-1 IgG滴度升高，3只犬中未检测到，退出研究的犬未进行检测。所有犬均未检出DSG1的IgG。有3只犬发生了不良反应。

结论和临床重要性：在一些cPF病例中单独使用布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂治疗可能有较好的疗效。

1.简介

尽管犬落叶型天疱疮 (cPF) 是一种不常见的疾病，但其可能是犬最常见的自体免疫性皮肤病之一。这种疾病通常有两种表现形式：分布于头部、面部、耳廓和爪垫的初期结痂型脓疱病，或全身结痂型皮肤病，后者更常伴有全身性症状，如发热或嗜睡。其潜在机制被认为是II型免疫反应，由直接针对跨膜蛋白-桥粒糖蛋白-1(DSC-1)和（在少数犬）桥粒芯糖蛋白-1(DSG-1)介导。组织学通常表现为中性粒细胞性脓疱病。cPF的治疗一般采用糖皮质激素，常辅以其他免疫抑制药物如硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环孢菌素或麦考酚酯。所有这些药物均有不良反应，可能包括多尿、多饮、多食、骨髓抑制、肝毒性、糖尿病和感染易感性的增加。尽管较早的文献报道cPF的致死率高达60.5%，生存时间与治疗不良反应的数量呈负相关，但最近的报道显示死亡率低得多，可能是由于较新的皮质类固醇药物以及使用脉冲皮质类固醇方案所致。然而，寻找另外的对cPF安全有效的治疗方案是兽医皮肤病学的重要策略。

布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是人体健康中支持体液免疫的蛋白质。它首次出现在一种最终被命名为X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的疾病，该病由美国医生Ogden C. Bruton报道。BTK是一种由659个氨基酸组成的蛋白质，在B细胞发育和功能中发挥着重要作用，因为该酶可传递和放大多种表面分子的信号，并使其多元化，在B细胞受体信号转导和细胞迁移中发挥重要作用。BTK介导B细胞受体对抗原结合的应答以及通过CD40、toll样受体、Fc受体和趋化因子受体对刺激的应答。自体反应性B细胞比正常B细胞更依赖于BTK存活，当不存在BTK时，总抗体水平维持不变情况下自体抗体会减少。

在小鼠实验中，转基因BTK过度表达引起系统性红斑狼疮样疾病，而25%正常水平的BTK表达减少了自体抗体的产生，并消除了自体免疫综合征。所有供试种属（啮齿类动物、犬、非人灵长类动物和人）的BTK蛋白序列比对的同源性为99%。

布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)药物通过抑制非T细胞白细胞（包括B细胞、中性粒细胞和肥大细胞）中的BTK，减少B细胞受体以及B细胞和其他非T细胞白细胞上FCcR（表面IgG受体）的下游信号转导来发挥作用。这些药物降低外周B细胞成长为成熟外周B细胞的能力，从而干扰该细胞的增殖、分化和存活。研究显示，BTKis对人和犬的一些B细胞恶性肿瘤均有效。已报道两种不同的BTKi分子对人类天疱疮（主要是寻常型变体）和多发性硬化有效。有几种BTKi分子正在开发或临床试验中。

PRN473是由原理生物制药(美国，加利福尼亚州，南部旧金山，原理生物制药有限公司) 开发的一种新型试验用BTKi。发现其在人体中口服吸收较差，但在犬中吸收良好。PRN473是一种可逆性共价BTK抑制剂，选择性结合BTK，靶点停留时间长，全身清除快。在使用全长重组BTK的动力学竞争试验中，PRN473的BTK停留时间延长>200h，在大鼠外周血单核细胞(PBMC)中>24h，通过具有快速全身清除的细胞测定，BTK的缓慢解离速率导致具有较长的作用持续时间和较好的疗效，同时降低脱靶毒性的可能。PRN473通过抑制巨噬细胞抗原-1信号转导抑制中性粒细胞募集，并在自体免疫性疾病动物实验如大鼠胶原诱导的关节炎(CIA)的实验中证实了疗效。

在本研究之前，PRN473已在健康比格犬中进行了广泛的毒理学试验，包括原理生物制药进行的一项12周极高剂量药物非临床研究质量管理规范(GLP)研究。在该研究中，使用≤400mg/kg/d剂量时，仅观察到活动减少和体重减轻，尤其是在雌性动物中。该研究中雄性动物未观察到不良反应的剂量(NOEAL)为400mg/kg，雌性动物为120mg/kg。（未观察到不良反应剂量，No Observed Adverse Effect Level (NOEAL)：指外源化学物在一定时间内按一定方式或途径与机体接触后，根据目前认识水平，用最灵敏的试验方法和观察指标，未能观察到对机体造成任何损害作用或使机体出现异常反应的最高剂量。）

由于上述BTK在B细胞信号转导、自体抗体产生和PRN473抑制中性粒细胞募集能力中的重要性，我们推断BTKi可有效治疗cPF。本研究的主要目的是确定在自然发生PF的犬中的疗效和安全性。次要目的是评价治疗期前后的抗DSC-1和抗DSG-1 IgG滴度血清水平的所有变化；推断随着B细胞信号转导减少，产生的抗DSC-1和抗DSG-1 IgG将减少。

2.方法和材料

2.1 研究设计和动物

这是一项初探性、非盲研究；方案获得了加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会以及临床试验审查委员会的批准，并遵循其指导原则（方案编号18353）。

入选标准：如果符合以下标准，则将犬纳入研究：(i)符合角质层下脓疱病的临床特征（脓疱、浅层糜烂和结痂）；(ii)组织学证实为角质层下脓疱性皮炎伴棘层松解；(iii)组织病理学评估和/或真菌培养显示高碘酸希夫（过碘酸希夫反应）染色未见皮肤癣菌；(iv)适当抗生素治疗无改善或改善极小；(v)既往未接受过适当免疫抑制药物治疗或治疗失败。

排除标准：如果犬妊娠或患有活跃性全身性疾病（包括肿瘤形成），则将其排除。

2.2 实验过程

采血时间为0、4和24h；2、4、8、12、16和20周。通过颈静脉穿刺采集血液至8mL枸橼酸钠单核细胞玻璃制备管（真空单核细胞制备管采血管；美国新泽西州富兰克林湖；BD医疗）中，用于外周血单核细胞（PBMC）分离。简言之，血液在室温下以1800g不间断离心20min。收集PBMC，并用250g磷酸盐缓冲液（PBS）（美国纽约格兰德岛；GIBCO公司）清洗两次，持续5min。取出等份PBMC，计数(美国佛罗里达州海厄利亚；贝克曼库尔特AcTDiff细胞计数仪 ) 并用抗CD21抗体（克隆CA2.1D6，白细胞抗原生物学实验室；美国加州大学戴维斯分校）标记，随后用驴抗小鼠Ig-PE (Jackson ImmunoResearch实验室；美国宾夕法尼亚州西格里夫) 检测B细胞。在配有CXP软件的FC500流式细胞仪（计数仪）上读取标记细胞。使用FLOWJO软件 (美国俄勒冈州亚什兰集团) 测定淋巴细胞群中B细胞的百分比。剩余PBMCs用缓冲、浓缩(910)氯化铵裂解试剂(美国BD医疗BD PharmLyseTM裂解缓冲液)处理，沉淀、速冻并储存在-80℃下，直至分析BTK占有率。

采用硼-二吡咯亚甲基（荧光）标记的BTK探针，在竞争试验中测定BTK结合率（PBMC中与PRN473结合的BTK酶的百分比），统一为总BTK，并计算处理样本中结合探针相对于给药前PBMC样本的比值。探针标记的PBMC蛋白组分在变性凝胶上通过电泳分离；探针和总BTK通过图像扫描进行硼-二吡咯亚甲基荧光和总BTK定量。在每次采血时进行这些分析。

本研究中使用的所有体外试剂均在犬样本中进行了交叉反应性检测，并证实具有与其他种属相似的反应性。本研究中使用的BTK探针PRN933和BTK检测抗体（克隆53，BD生物科学；美国加州圣何塞）与先前啮齿类动物和犬研究中使用和发表的抗体相同，原理生物制药报告可选择性检测所有种属的BTK。PRN933是使用先前发表的结构在内部合成的，并验证了其与这些结果具有/相似的结合亲和力。

DSC-1和DSG-1的IgG滴度测定如前所述。按照1:20、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200检测所有血清，记录最后一次阳性稀释度。在每只犬给药期之前和结束时，测定Desmocollin-1和DSG-1 (IgG)滴度。

2.3 药物治疗

PRN473是100mg片剂。剂量为每日15mg/kg，与食物同服。与食物同服时，该药剂量基于啮齿类动物和比格犬的临床前研究结果。如果研究者认为治疗2-4周后犬的病变未缓解，或如果认为BTK结合率数据低于最佳水平，则剂量可加倍。如果根据下文判断犬的反应良好，则在12周后尝试降至每隔一天一次，治疗维持16-20周。

2.4 监测

通过全血细胞计数(CBC)、血清生化检查和尿液分析对犬进行监测。使用经过验证的犬改良版的人类天疱疮疾病活动指数（cPDAI；图S1）对其进行半定量评估。改良包括重新命名（用爪子代替脚）或犬的特定解剖结构（包括鼻平面、口周和尾部）。治疗结束时，定性评估犬对治疗的反应为良好（>90%的病变在单独药物治疗时完全缓解）、一般（≥50%的病变缓解，但需要皮质类固醇）或较差（前两周后病变无缓解，随后需要传统药物干预）。将疗效较差或出现需要中止治疗的不良反应的犬从临床试验中移除。

在接受PRN473的第2、4、8、12、16和20周对犬进行监测/评估。由两名不了解对方评分和结果平均值的兽医通过cPDAI进行评估。

2.5 统计学评估

使用Wilcoxon秩和检验确定疗效与BTKi中位占用率（4和24h）以及抗DSC-1滴度之间的相关性。P<0.05被视为具有显著差异。使用统计软件进行分析。

2.6 结果

9只最近诊断为（检查前3周至3个月）cPF的犬，接受了PRN473治疗。初始剂量为8-21mg/kg/d（中位剂量为13mg/kg/d），最后剂量为14-38mg/kg/d（中位剂量为17mg/kg/d）。临床详情和疗效见表1。所有9只犬最初都有很好的临床疗效，治疗第2周结束时病变减少。

表1. 使用PRN473的犬的临床和实验室数据

良好：90%的病变缓解；一般：50%的病变缓解，需要皮质类固醇；较差：使用BTKi后出现最小缓解或无缓解

停用PRN473后，所有犬的PF均复发或恶化。

ND：不可检出；NP：未检测；u.i.：尿失禁；IMPA：免疫介导的多发性关节炎；MCT：肥大细胞瘤；DSC1桥粒糖蛋白1抗体

*在20周研究结束时停药后重新给药，重新给药后反应良好。

†BTKi未能控制的重度过敏性皮肤病，需要皮质类固醇治疗。

‡最初两周反应良好，然后复发。

¶EOD？能否隔天给药一次？

§BTKi能够降低至较低剂量。

4只犬（犬1、3-5）在第4周结束时有持续缓解；犬1、3和4在20周研究结束时显示接近完全缓解；这在临床上观察到（图1），并反映在cPDAI中（图2）。犬5尽管疗效良好，但由于发生免疫介导的多关节病(IMPA)，在12周时退出研究。尽管最初病变有所缓解，但犬2和7在第8周时、犬6和9在第16周时因疗效较差或一般而退出了试验。三只犬(2、6、9)的病变对BTKi的反应不够迅速，不足以缓解不适，在BTKi试验的第6周时需要干预，分别在随后的第8、16增加免疫抑制剂泼尼松龙（1mg/kg，每日两次），并在16周退出。

图1. 犬1的左前爪(a)在初诊时和(b)单独使用PRN473治疗后1个月

图2. 使用PRN473的9只犬随时间推移的犬天疱疮疾病活动指数 (cPDAI) 评分

犬8病变有良好缓解，但由于先前切除的肥大细胞瘤（伴转移）复发，在前4周后退出研究。仅两只犬(1、3)的剂量能够降低至每隔一天一次。在第20周停用PRN473后，犬1在复发前6个月未使用药物的情况下保持缓解，之后再次使用PRN473进行治疗，在2个月内产生良好的临床疗效，直至发生IMPA，此时发生了药物不良反应而停用BTKi。其他犬在BTKi治疗中断后复发。3只犬(3、6、9)在开始接受PRN473之前患有重度过敏性皮炎（最可能是异位性皮炎），对BTKi无反应。

PRN473的耐受性通常良好；在CBC、血清生化全套或尿液分析中未观察到一致的异常。2只犬(1，5)在接受PRN473时并发了IMPA和外周淋巴结病。犬停用PRN473后，IMPA还持续存在。对犬1的淋巴结病，细针抽吸显示中度至重度淋巴组织增生、浆细胞增多和嗜酸性粒细胞炎症；未对犬5进行采样。在使用PRN473期间，两只犬的淋巴结病在未接受治疗的情况下缓解。犬5还出现腹泻和食欲不振；超声检查发现与慢性胰腺炎相符的变化。通过饮食控制，腹泻得到缓解。

DSC-1的IgG滴度在犬1、4和5中有所降低，均具有良好的临床疗效。（DSC-1的IgG滴度）在疗效较差或一般的犬6和7中有所增加，3只犬(2、3、9)在给药前和给药后均未检测到滴度。犬8因肥大细胞瘤的治疗而未进行滴度测定。在具有完整数据和得到充分治疗的5只犬中，疗效与抗DSC-1滴度变化（升高或降低）之间的相关系数无统计学显著差异(Z=1.194，P=0.2324)。无犬出现DSG-1阳性滴度。

对治疗反应差或一般的犬的BTK中位占有率为60%-92%，反应良好的犬为27%-84%，两组间无显著差异（Z=-1.350，P=0.1771）。CD21结果显示检查期间B细胞百分比是多变的，但在下一次检查时所有的下降均反弹回来了，表明在PRN473治疗过程中没有持续性B细胞计数减少（数据未显示）。

3.讨论

BTKi PRN473在治疗cPF中的作用尚不完全清楚，但推测是由于其干扰了多种炎症途径，包括中性粒细胞迁移（cPF在组织学上主要表现为中性粒细胞浸润）、B淋巴细胞功能，以及延伸并减少针对跨膜蛋白（如DSC-1）的自体抗体的产生。

犬已用于各种BTKi分子代谢和毒性的临床前研究。然而，除了上述使用BTKi治疗犬B细胞淋巴瘤和本研究中报道的7只犬的部分结果外，作者不了解其他关于BTKi药物治疗犬疾病的研究。在人医中，PRN1008是一种与PRN473（也由原理生物制药生产）非常相似的BTKi，在健康志愿者中耐受良好。在一项同时治疗落叶型天疱疮和寻常型天疱疮的开放性研究中，61%的患者使用PRN1008治疗4周后达到了控制疾病活动的主要终点，这些患者伴随使用的泼尼松日剂量为0-30mg。

在我们的研究中，认为犬1、3、4和5的反应良好，犬7和9的反应一般，犬2和6的反应较差，犬8的治疗期太短而无法确定反应。有趣的是，良好疗效与占用率数据无统计学相关性，这与用不同BTKi治疗的关节炎小鼠实验中的结果相反。如另一种BTKi的报告中所说的，这可能是由于不同种的BTKi代谢差异所致。在毒理学研究中未观察到高剂量组的体重减轻。尚不确定在犬1和5中观察到的IMPA是否与BTKi相关，或是否恰好是两只老年犬的原因。在本研究期间，相对于全科医院，在我们医院诊断为IMPA的犬占0.45%。然而，先前一项针对cPF并发其他免疫介导疾病的研究发现，23.5%的cPF犬并发了IMPA。值得注意的是，在研究结束后停用BTKi，IMPA持续存在。

尚不确定在犬5中观察到的腹泻和食欲不振（通过饮食控制缓解）是否与BTKi给药相关，或可能与腹部超声检查观察到的慢性胰腺炎相关。犬8在仅治疗3周后，肥大细胞瘤（伴转移）复发了，这不太可能是由于BTKi所致，给予其它BTKi分子对犬肥大细胞瘤和其它圆形细胞瘤（淋巴瘤）有抗肿瘤作用的，它们对肥大细胞瘤的耐药性及对肥大细胞脱颗粒和活化有抑制作用。此外，在不使用BTK的情况下，小鼠肥大细胞的发育似乎是正常的。然而，这些潜在不良反应需要在进一步的犬使用BTKi分子的研究中进行更密切的评估。在各种BTKi中，尽管精心设计仅与BTK结合，但仍观察到脱靶效应，这可能解释了一些犬发生的不良反应。事实上，在犬中发现另一种BTKi可诱导肝毒性。如我们的研究中所见，在PRN473治疗过程中没有持续性的B细胞计数减少，故我们确切认为PRN473不会诱导泛B细胞缺乏症。

cPDAI在人类的临床表现结果并不能完全适应于犬。尤其是，难以评估对病变数量的依赖性——因为在犬中，PF病变通常是融合的而不是保持单个存在。此外，胸部、背部和腹部之间的区别在犬中的定义不同。最后，用来评估病变恶化的评分不是连续的(1、2、3、5、7、10)，可能过分强调了严重程度（从7到10而不是7到8）和改善（从10到7而不是10到9）。这可能解释了犬6和犬9的定性评估（差和一般）与cPDAI（显示平均评分较低，为15/100）之间的差异。尽管存在这些困难，但cPDAI大体反映了犬个体对治疗的反应过程。

因为仅在少数cPF犬中DSG-1被标记作为靶向抗原，所以事实上，几乎普遍存在于人类中的抗DSG-1抗体，在犬中并不存在。之前已经证实并非所有犬均可检测到抗DSC-1抗体，这可能是由于免疫荧光技术固有的较低灵敏度，具有典型面部cPF的犬与更趋向于躯干/全身分布的犬之间存在差异，一些犬具有抗未知抗原的自体抗体或将这些因子组合的可能性。疗效良好的3只犬（1、4和5）的抗DSC-1抗体滴度降低，而疗效较差或一般的2只犬（6和7）增加，表明该试验在监测疗效方面可能发挥作用。

本研究的局限性在于治疗的犬数量较少且缺乏对照组。在如此小的队列中，无法解释潜在品种的药物遗传学差异，从而导致临床疗效的多变性。

总之，单独使用BTKi PRN473来治疗cPF，在9只犬中有4只比较成功（3只接受完整疗程，1只提前退出），在另外2只疗效一般的犬中作为辅助治疗可能有帮助。需要在控制范围内，在大量的不同品种的犬中进一步使用该药物。

参考文献：略

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