广东海洋大学、中国水产科学研究院南海水产研究所联合培养硕士研究生孙康婷（第一作者）和中国水产科学研究院南海水产研究所潘创副研究员、陈胜军研究员（共同通信作者）通过传统的蛋白质品质研究、蛋白质组学分析和生物信息学分析研究、鉴定和描述微冻贮藏与虾肉质量相关的蛋白质。
Introduction
南美白对虾（Litopenaeus vannamei）是一种蛋白含量丰富的高营养水产品。蛋白质是水产品肌肉的一个基本组成部分。它的结构被破坏后引起不可逆的物理变化。内源性蛋白酶将蛋白质降解，形成小分子的肽和非蛋白氮，分解产物进一步分解，产生硫化物等挥发性产物，导致难闻的气味。
新鲜度对水产品品质具有重大意义，直接决定了产品的食用价值以及经济价值。与冻藏和冷藏相比，微冻最大程度地维持了水产品的状态以及延长贮藏期限，是一种在短期内保持品质的较好方法。蛋白质组学是一种强大的工具，有助于补充蛋白质的信息，可以揭示肌肉蛋白质和产品的质量特征之间的联系。通过结合传统的品质研究和生物信息学分析，对微冻储存期间的蛋白质变化进行洞察，是一种分析储存期间虾肉品质变化的方法。
Results and discussion
蛋白指标分析
总巯基含量表征蛋白质的氧化程度，含量越低说明蛋白氧化程度越高。随着贮藏时间的延长，虾肉在－3 ℃下的总巯基含量明显下降（图1A）。在本研究中，初始值为33.785 μmol/g prot，4 周后降至19.718 μmol/g prot。总巯基含量的减少是蛋白质的巯基基团之间形成交联以及暴露的巯基基团与其他化合物之间相互作用的结果。
Ca 2＋ -ATP酶活性是水产品中蛋白质变性的一个指标。肌球蛋白头部区域的Ca 2＋ -ATP酶活性的丧失将影响肌球蛋白和肌动蛋白的完整性，从而进一步导致蛋白质的变性。如图1B所示，随着贮藏时间的延长，虾仁肌肉在－3 ℃时的Ca 2＋ -ATP酶含量明显下降。蛋白质与蛋白质相互作用的重排和冰晶的形成破坏了持水能力和蛋白质的完整性，这是Ca 2＋ -ATP酶活性降低的原因。
表面疏水性是衡量蛋白质变性程度的蛋白质指标之一，由疏水性氨基酸的相对含量决定。表面疏水性在4 周内的变化如图1C所示。虾类样品的表面疏水性值在4 周贮藏过程中呈现上升趋势，表明蛋白质侧链中的疏水基团暴露，蛋白质在－3 ℃下发生降解。暴露的疏水残基可能通过疏水相互作用导致蛋白质的聚集。同时微冻会使肌纤维蛋白展开，暴露出疏水的脂肪族和芳香族氨基酸残基，改变亲水基团和疏水基团的位置，导致蛋白质的构象变化。
蛋白质羰基化是用于评估蛋白质氧化程度的指标之一。图1D显示了对虾肌肉中肌纤维蛋白羰基含量的变化，随着贮藏时间的延长，羰基含量显著上升。羰基主要是通过自由基的攻击和肽链的裂解使氨基酸的侧链与NH2氧化而产生。特定氨基酸侧链形成的蛋白质羰基与肌纤维蛋白的构象变化有关，可能导致碎片化、聚集、丧失溶解性和功能性。
（A）总巯基含量；（B）Ca2＋-ATP酶活性；（C）表面疏水性；（D）羰基含量；（E）分子间键含量；（F） SDS-PAGE图谱。
图1 虾肉蛋白质指标在－3 ℃下的变化
分子作用力变化
分子间作用力包括离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键。如图1E所示，疏水相互作用在贮藏0~1 周没有明显变化，二硫键在贮藏1~2 周没有明显变化。然而，就整体变化趋势而言，二硫键和疏水相互作用明显增加，而离子键和氢键的强度明显下降。二硫键的增加主要是由于巯基基团的氧化，这与巯基基团的含量呈负相关。肌肉蛋白在贮藏过程中的构型变化导致了疏水基团的暴露。疏水相互作用和二硫键的增加表明蛋白质之间形成了更广泛、更紧密的网络。
电泳图谱分析和目标蛋白鉴定
SDS-PAGE是通过分离不同分子质量的生物大分子来确定分子蛋白质质量和识别生物大分子的工具。虾肌肉蛋白质的分子质量主要位于17~200 kDa（图1F）。电泳图显示，在4 周贮藏过程中，样品总蛋白有一定程度变化。约180 kDa的肌球蛋白重链条带强度随着微冻贮藏期的延长而下降。分子量为20 kDa的肌球蛋白轻链逐渐减弱。与新鲜样品相比，贮藏4 周样品中约97 kDa和50 kDa的蛋白质条带强度下降。这种下降可能是由低温贮藏期间的变性、蛋白质分解和氧化造成的。此外，贮藏期间在30 kDa以上的区域发现了一个新条带。
为验证与南美白对虾品质相关的蛋白，将SDS-PAGE条带切断，并通过LC-MS/MS进一步鉴定。鉴定的3 个蛋白质氨基酸序列分别为28、39 个和5 个，分别为α-肌动蛋白（GenBank登录号：ROT76585.1），肌联蛋白I（GenBank登录号：ROT65894.1）和肌钙蛋白I（GenBank登录号：AFW99840.1）。这3 个蛋白质是肌纤维蛋白的重要组成部分。肌纤维蛋白约占肌肉组织蛋白的50%~70%，负责肌肉收缩等生理活动。
目标蛋白生物信息学分析
α-肌动蛋白是Z-盘的主要成分，有助于稳定肌群的结构。肌联蛋白I存在于粗丝中，而肌钙蛋白I存在于肌纤维的细丝中。它们在组织肌节方面都有重要作用。这些韧带成分的降解或蛋白质分解会逐渐导致结构完整性的丧失，从而削弱肌肉组织。甲壳类动物的许多蛋白质在死后贮藏期间被内源酶和微生物活动降解。由于结构蛋白的降解和变性，导致肌肉结构的改变，从而使产品的品质下降。
表1 目标蛋白的相关信息和蛋白预测
α-肌动蛋白在UniProt上找到蛋白质条目标识符为A0A423TJG5（表1）。对α-肌动蛋白的理化性质和疏水性进行分析，结果显示α-肌动蛋白含有1 081 个氨基酸，不稳定系数为40.73，属于不稳定蛋白，在体外稳定性不高，容易降解（标准<40为稳定蛋白）。采用Protscale分析α-肌动蛋白的疏水性，结果（图2A）表明，氨基酸序列主要分布在亲水区，推测为亲水蛋白。疏水性氨基酸之间的相互作用是维持蛋白质结构稳定性的主要力量，蛋白质的亲水分布可以反映蛋白质的折叠情况。疏水性不仅对蛋白质的稳定性有微妙的控制作用，而且对α-螺旋构象也有影响。通过SOPMA在线软件对α-肌动蛋白的二级结构进行分析，结果显示，α-螺旋和无规卷曲的分布范围比较全面，分别占68.18%和21.46%（图3A、D）。这种结构分布意味着二级结构相对稳定，但存在着与其他结构蛋白结合的可能性。通过NCBI中的结构域和结构确定蛋白质序列的功能域，结果显示整个序列都是功能域序列。利用ToxinPred2网站中的BLAST搜索功能， A0A423TJG5序列的搜索序列为1~16，结果显示该蛋白是无毒的（表1）。预测蛋白质中的蛋白质序列可以提前预测肽的毒性，从而有助于进一步删除或改变这些肽。
（A）α-肌动蛋白；（B）肌联蛋白I；（C）肌钙蛋白I。
图2 虾肉蛋白质在－3 ℃贮藏时亲水性的变化
（A~C）α-肌动蛋白、肌联蛋白I、肌钙蛋白I的二级结构简图；（D）α-肌动蛋白、肌联蛋白I和肌钙蛋白I的二级结构分布（横轴表示该蛋白中氨基酸的位置；蓝、绿、红、紫分别代表α-螺旋、β-转角、延伸链、无规卷曲）。
图3 虾肉蛋白质二级结构在－3 ℃贮藏时的变化
肌联蛋白I是一个巨大的弹簧状蛋白，通过GenBank登录号在UniProt上找到蛋白条目标识符为A0A3R7NSY1（表1）。结果显示，肌联蛋白I包含2 811个氨基酸，不稳定系数的为39.26，属于稳定蛋白。肌联蛋白疏水氨基酸残基的数量少于亲水氨基酸的数量（图2B），属于亲水蛋白。肌联蛋白I的二级结构以无规卷曲（51.25%）和延伸链（26.08%）为主，而α-螺旋和β-转角仅占17.10%和5.57%（图3B、D）。这些分子的脂质和水结合亲和力的变化是因为蛋白质-蛋白质相互作用导致了蛋白质分子的次级变化。采用相同的方法分析该蛋白的功能域，结果显示A0A3R7NSY1的整个序列是一个功能域序列。ToxinPred2网站的BLAST搜索比较了数据库中的41 个已知序列，结果显示该蛋白是无毒的（表1）。对已知的蛋白质进行生化分析对应用蛋白质作为食品质量控制的潜在生物标志物至关重要。
肌钙蛋白I的变化与α-肌动蛋白的变化一样，主要与肌纤维蛋白的降解有关。利用肌钙蛋白I的GenBank登录号，在UniProt上找到蛋白质条目标识符为K7WDK6（表1）。结果显示，肌钙蛋白I包含195 个氨基酸，其不稳定系数为48.82，属于不稳定蛋白。该氨基酸序列几乎覆盖了亲水区，是一种亲水蛋白（图2C）。已有研究表明酪蛋白酶的活性随着贮藏时间的延长而降低，肌钙蛋白I也被部分降解。虾肌肉在贮藏过程中的品质下降主要是由于低丰度蛋白的降解。贮藏期间低分子质量带III的出现，推测为蛋白酶作用的降解产物。肌钙蛋白I的二级结构以α-螺旋（71.79%）和无规卷曲（22.56%）为主，而β-转角和延伸链只占2.56%和3.08%（图3C、D）。肌钙蛋白I和α-肌动蛋白这两种蛋白质的二级结构有相同的分布趋势，均以α-螺旋和无规则卷曲为主。肌联蛋白I是一种稳定蛋白质，以无规卷曲和延伸链为主。对该蛋白序列的毒性进行预测，并与数据库中的三组序列进行比较，结果显示该蛋白是无毒的。
Conclusion
本研究评估了微冻贮藏4 周期间虾肉的蛋白质变化。与新鲜虾相比，贮藏4 周的南美白对虾羰基含量和表面疏水性增加，总巯基含量和Ca2＋-ATP酶活性下降，虾肉的品质发生劣变。同样，虾肉在贮藏4 周后二硫键和疏水相互作用明显增加，离子键和氢键明显减少。SDS-PAGE分析和LC-MS/MS鉴定显示，一些蛋白质在贮藏期间发生变化，被鉴定为α-肌动蛋白、肌联蛋白I和肌钙蛋白I。α-肌动蛋白和肌钙蛋白I是不稳定的蛋白质；二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。肌联蛋白I是一种稳定的蛋白质，其二级结构主要由无规卷曲和延伸链组成。对这些蛋白质的进一步生化分析提供了关于蛋白质特性和毒性的相关知识，以进一步提高贮藏期间虾肉的安全性。
Abstract
Proteins play a substantial role in the deterioration of partial freezing shrimp product quality. In this study, traditional protein indicators were used to determine changes in shrimp muscle quality during storage, and the changed proteins were identified using proteomic analysis. The decrease in total sulfhydryl (SH) content and the increase in carbonyl content indicate protein is denatured. The decrease in Ca2+-ATPase activity and the increase in surface hydrophobicity also indicate protein denatured. The increase of hydrophobic interaction and disulfide bonds suggest a larger and closer network among proteins. A total of eight changed protein bands were detected on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) diagram under partial freezing storage. Three of them were identified as α-actinin (97 kDa), invertebrate connectin (I-connectin (55 kDa)), and troponin I (30 kDa), respectively, which are essential components of myofibrillar protein. The results of the bioinformatic analysis showed that α-actinin and troponin I are unstable proteins with a secondary structure dominated by α-helix, while I-connectin is a stable protein with a secondary structure dominated by random coil. All three proteins are hydrophilic and predicted to be non-toxic on ToxinPreds.
专家介绍
陈胜军 研究员
中国水产科学研究院南海水产研究所食品工程与质量安全研究室 主任
农业农村部水产品加工重点实验室 主任
广东省现代农业产业体系水产品质量安全领域研发创新团队 首席专家
陈胜军，男，中共党员，研究员，工学博士，博士生导师。现任中国水产科学研究院南海水产研究所食品工程与质量安全研究室主任，农业农村部水产品加工重点实验室主任，农业农村部水产品贮藏保鲜风险评估实验室主任。中国水产科学研究院水产品精深加工与高值化利用创新团队首席专家，广东省现代农业产业体系水产品质量安全领域创新团队首席专家。中国海洋大学、上海海洋大学、广东海洋大学、南京农业大学、中国农业科学院等高校研究生导师。国家农产品加工产业科技创新联盟预制菜专业委员会执行专家。广东省预制菜产业联合研究院理事。
主要从事水产品高值化精深加工与质量安全控制研究工作。以鱼、虾、贝、藻等大宗、特种水产品为原料，在高值化精深加工、加工下脚料综合利用、新产品研究与开发、水产品质量安全控制和标准制修订等方面开展了深入研究。科研成果为生产实际提供了理论支撑与技术支持，并在广东、广西、海南、福建和湖北等省多家企业推广应用，取得良好的经济效益和社会效益。主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发计划项目子课题、广东省重点研究计划课题和广东省现代农业产业技术体系水产品质量安全和环境协调创新团队等项目50余项。获各级科技成果奖励20余项次，其中省部级一等奖6 项、二等奖4 项。公开发表学术论文280余篇，其中SCI/EI收录80余篇；获国家授权发明专利30余项；主持和参与制（修）定国家、行业及地方标准40余项。
Food Science of Animal Products副主编，《食品科学（EI）》《肉类研究》《中国渔业质量与标准》等杂志编委，及担任Food Chemistry、International Journal of Biological Macromolecules、Journal of Aquatic Food Product Technology、《食品科学》《南方水产科学》等国内外学术期刊审稿人。
潘创 副研究员
中国水产科学研究院南海水产研究所
潘创，留日博士（日本国政府奖学金获得者），副研究员，广东省现代农业产业技术体系水产品质量安全创新团队秘书。主要从事水产品精深加工、保质贮运及相关标准制订等方面的工作。主持与参与科研项目20余项，其中主持农业农村部“科技助力经济2020”重点专项（课题）、广东省自然科学基金、海南省自然科学基金等科研项目9项；在国内外公开发表学术论文50余篇，其中以第一作者及通信作者发表SCI期刊发表论文15 篇；参编专著2 部，参与研制国家标准样品3 个，主笔起草广东省地方标准5 项，授权发明专利5 项。作为团队主要骨干获得“广东省现代农业产业技术体系优秀创新团队”荣誉称号。
第一作者介绍
孙康婷 硕士研究生
孙康婷，广东海洋大学与中国水产科学研究院南海水产研究所联合培养2020级硕士研究生，以第一作者发表SCI期刊发表论文1 篇，EI收录1 篇，以第二作者发表SCI期刊发表论文1 篇。
编辑：李婉君；责任编辑：张睿梅
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于2023年5月13-14日在中国宁夏银川共同举办“生态保护与食品可持续发展国际研讨会”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
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