农业微生物技术教育部工程研究中心（黑龙江大学）、济宁市产业技术研究院有限公司、黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室的李秀凉副教授（第一作者）和农业微生物技术教育部工程研究中心（黑龙江大学）、济宁市产业技术研究院有限公司、黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高等学校微生物重点实验室的孙庆申教授（通信作者）研究黑木耳多糖（APs）与乳清分离蛋白（WPI）的相互作用机理。采用研究圆二色光谱（CD）、X射线衍射（XRD）、原子力显微镜（AFM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析不同pH值下WPI与APs的相互作用。此外，通过分子对接技术揭示WPI与APs相互作用的结合位点、相互作用类型和结构变化等详细信息。
Introduction
WPI因其营养价值丰富、易于获得、成本低廉等优点用于多种高蛋白质饮料的开发。然而，无涩味高蛋白质饮料的pH一般控制在4.0–6.0左右，这与WPI的等电点（pH 5.2）重叠。WPI在该pH值范围下易于出现聚集和沉淀现象，使得高蛋白饮料的发展受到了一定限制。黑木耳（Auricularia auricula）是我国重要的药食同源真菌，其中多糖为其主要的活性成分，高达70%以上。相关研究表明APs具有抗氧化、抗癌、提高免疫等多种功能活性。APs属于高分子质量多糖，因此可以通过增加酸化乳饮料的黏度，从而提高其稳定性。本研究旨在研究WPI与APs的结构特征及其分子相互作用机制。
Result and analysis
浊度分析
通过浊度分析研究APs-WPI中配合物的形成与混合比（3:1、1:1、1:3、1:4、1:6和1:9，m/m）的关系（图1）。在所有双聚合物混合比下，pHc保持不变，而pHopt随着WPI比例的降低而降低。这一趋势与先前其他研究者的报道一致。pHc中可溶性复合物的形成是分子水平的转变，不受混合比例和总大分子浓度的影响。当APs/WPI的混合比大于1:4时，浊度在较窄的范围内增加，说明APs链数处于过量状态。
图1 不同混合比例APs-WPI复合物在pH 2.0~7.0的浊度
AP-WPI复合物在pHopt下的形态
利用AFM进一步表征不同pHopt值下APs-WPI配合物的形态（图2）。直接观察到延伸的刚性链构象。冻干后的WPI溶液液滴结构表面较为完整，内部颗粒主要呈球形结构。如图2所示，pHopt作用下的APs-WPI复合物（3:1，m/m）表面呈不规则片状，边缘为圆角，具有紧密致密的网状结构。随着APs比例的增加，大多数多糖链主要转向组装，形成串状纳米纤维，并倾向于形成连续相，如薄膜或片层。此外，随着APs比例的增加，可以清楚地观察到网络结构。这表明网络结构可能是由APs链形成的。因此推测较高的多糖比例有利于形成稳定的生物聚合物网来包裹蛋白质，因此聚集的分子不能形成沉淀。
（a）APs-WPI=1:1 （m/m）；（b） APs-WPI = 1:3 （m/m）；（c） APs-WPI = 1:4 （m/m）；（d） APs-WPI = 1:6（m/m）；（e） APs-WPI=1:9（m/m）；（f） APs-WPI=3:1 （m/m）。
图2pHopt下APs-WPI溶液的AFM图像
AP-WPI复合物在特征pH值下的蛋白构象变化
图3 显示了APs-WPI溶液在pHc 和pHopt下的FTIR光谱，以及WPI、APs和APs-WPI（1:1、3:1和1:9）在pHopt下的XRD光谱。酰胺I带的特征峰（1 600~1 700 cm－1）可用于分析蛋白质的二级结构，主要包括C—O拉伸振动、C—N拉伸振动、C—C—N弯曲振动和N—H平面弯曲振动。研究表明，当APs /WPI比为1:9时，在pH 6.0时，不同APs/WPI比的复合物分别在1 649.88 （APs/WPI=1:9）、1 650.40 cm－1（APs/WPI=1:1）和1 654.28 cm－1（APs/WPI=3:1）处出现了酰胺I峰。与APs相互作用后，WPI-APs样品的酰胺I峰向较高的波数处移动，说明APs/WPI的比例影响了复合物的结构。酰胺Ⅱ峰在pHc时1 548.48 cm－1（APs/WPI=1:1）向1 544.18 cm－1（APs/WPI=1:9）移动，说明AP与WPI通过疏水相互作用改变了WPI的二级结构。酰胺A峰（3 000~3 600 cm－1）的波数和强度都发生了变化，说明AP的引入也有助于复合物的氢键化。
图3 APs-WPI溶液在pHc（A）、pHopt（B）下的FTIR光谱，以及WPI、APs和APs-WPI（1:1、3:1和1:9）在pHopt（C）下的XRD光谱
如表1所示， AP /WPI为1:3、1:4、1:6、1:9、1:1、3:1时，α-螺旋含量均降低。当APs/WPI<1时（1:3、1:4、1:6、1:9）时，β-折叠含量降低；当比例为3:1和1:1时，β-折叠含量增加。β-折叠的增加有助于蛋白质疏水性区域的暴露，说明多糖的加入使蛋白质的疏水性基团暴露，疏水性显著增强。β-转角含量降低，而无规卷曲含量增加，说明APs的加入显著破坏了WPI的α-螺旋结构，提高了WPI的柔性，分子发生部分展开和再折叠。与pHopt 相比，α-螺旋和β-折叠含量降低。而pHc的β-转角和无规卷曲含量增加。在蛋白质结构中，β-折叠和β-转角结构与氢键有关。因此，可以推测APs和WPI复合物中存在氢键，并且混合比例和pH值对氢键产生影响。
表1 pHc和pHopt下WPI不同比例APs-WPI复合物的二级结构变化
黑木耳多糖与乳清分离蛋白的分子对接分析
通过分子对接分析，得到了WPI氨基酸残基与APs中β-葡聚糖的结合过程。β-Lg、α-La、乳过氧化物酶、乳铁蛋白、BSA与β-葡聚糖的结合能分别为－6.4、－8.3、－8.7、－8.9 kcal/mol和－7.8 kcal/mol。如图4A所示，β-Lg与APs通过氢键相互作用（Asn 109、Asn 90、Asn 88和Ser 116），APs与α-La通过Glu 49（范德华力）、Thr 33（氢键）和Ala 106（氢键）相互作用。如图4B所示，乳铁蛋白中与APs结合相关的氨基酸残基为Gln 600（氢键）、Arg 688（氢键）、Arg 91（氢键）、Arg 249（氢键）、Ala 322（氢键）、Lys 404（范德华力）（图4C）。APs通过氢键与乳过氧化物酶相互作用（Arg 255、 Gln 423、 Arg 400、Arg 248和His 351）（图4D），而APs通过氢键与BSA相互作用（Val 342、 Gln 220和Lys 294）和疏水相互作用（Asp 450）（图4E）。APs主要通过非共价结合与WPI相互作用，改变了WPI的结构。这些氢键增强了相互作用过程中非共价结合的强度，稳定了β-葡聚糖与WPI复合物的空间构象。
β-葡聚糖以蓝色表示，与β-葡聚糖结合相关的氨基酸残基以粉色表示。
图4 β-葡聚糖与β-Lg (A)、α-La (B)、乳铁蛋白(C)、乳过氧化物酶(D)和BSA(E)的结合方式
Conclusion
本研究通过非共价相互作用研究了APs与WPI在不同条件（pH值和混合比）下的复合行为。结果表明，APs可以通过氢键和疏水作用与WPI相互作用。浊度曲线显示，pH值和混合比对相互作用行为有影响。随着WPI与APs质量比的增加，复合物的临界pH值向更高的值移动，因为更多的WPI分子可用于与APs链结合。APs和WPI之间的相互作用也可能是pH依赖的，通过破坏或形成氢键。FTIR、CD和XRD结果表明，APs-WPI与WPI在二级结构和构象上存在差异。值得注意的是，从目前的研究来看，蛋白质-多糖络合的pH值和混合比例的优化是获得理想的复合物溶液微观结构和稳定性的前提。APs-WPI复合物在酸化乳剂领域的应用有待进一步研究。
Abstract
Biopolymer complexes fabricated by proteins and neutral polysaccharides have some specific and innovative functionalities. A better understanding of the interactions among these biopolymers might provide new insight into the applications of the complexes. Therefore, this study aimed to investigate the structural characteristics and molecular interaction mechanisms of whey protein isolates (WPI) and Auricularia auricular polysaccharides (APs). The turbidity analysis confirmed that the pH value and mixing ratio of the two polymers had strong effects on the formation of the APs-WPI complexes. All dispersions formed soluble complexes at approximately pH = 6.0 (pHc). APs-WPI self-assembles exhibited physically cross-linked networks under higher APs proportions, while they formed spherical complexes at higher WPI ratios. The addition of APs could alter the secondary structure of WPI, and the most noticeable changes were located in the regions of β-sheet and β-turn as confirmed by circular dichroism (CD) analysis. A molecular docking study showed that the amino acid residues of β-lactoglobulin complexed with the –COOH and –OH groups of APs. Hydrogen bonds and hydrophobic interactions, which were nonbonding contributions, played a key role in the formation of the APs-WPI complex. This study provided a basis for the development and application of APs in WPI-based beverages.
专家介绍
孙庆申 教授
黑龙江大学生命科学学院
孙庆申，男（1977—），第十二届黑龙江省青年科技奖获得者， 黑龙江省科协优秀青年科技人才，现为黑龙江大学生命科学学院专任教师，教授，硕士生导师，黑龙江省食品科学技术学会常务理事，黑龙江省轻工业协会常务理事，黑龙江省人民政府食品安全专家委员会专家，黑龙江省服务中小微企业、助力“百千万”工程专家学者（高技能人才）库成员，Food Scienc of Animal Products 编委、《食品工业科技》杂志青年编委，《乳业科学与技术》杂志编委。工作以来，主持国家青年科学基金项目、黑龙江省科技厅面上项目，黑龙江大学杰出青年基金项目、黑龙江省教育厅面上项目、黑龙江省科技攻关项目二级课题、黑龙江省博士后基金项目、黑龙江大学青年基金项目、黑龙江大学博士启动基金项目，同时参与了黑龙江省青年基金，黑龙江省教育厅指导项目的研究。培养硕士研究生40余名。公开发表论文70余篇，其中SCI收录论文15篇，出版专著1 部，授权国家技术发明专利6 项，获黑龙江省青年科技奖等各类奖项8 项。
第一作者介绍
李秀凉 副教授
黑龙江大学生命科学学院
李秀凉，女（1970—），副教授，中国营养学会注册营养师，硕士生导师，研究方向：食品和药物生物活性挖掘及研发。主要研究内容：乳酸菌调节肠道微生态；纳豆中活性物质的发掘与开发。主持黑龙江省自然科学基金联合引导项目1 项，黑龙江省教育厅面上项目2 项、哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目1 项、黑龙江省高校基本科研业务费黑龙江大学专项资金一般项目2 项、黑龙江大学青年基金项目1 项；主持横向课题1 项。参与国家自然科学基金面上项目3 项，参与省部级项目多项。培养硕士研究生30余名，出版专著1 部，主编教材1 部，参编教材3 部，第一发明人授权国家技术发明专利1 项，参与人授权国家发明专利5 项。获得黑龙江省高等学校科学技术奖（自然科学类）二等奖1 项。以第一作者或通信作者公开发表本领域研究核心论文30余篇，其中SCI收录论文5 篇。
编辑：李婉君；责任编辑：张睿梅
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
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