近年来，血栓成为继高血压、心脏病之后的又一类老年人高发疾病。血栓形成是心血管疾病致命性的主要原因，然而，大多数心脑血管疾病在发病前并无明显体征，发病突然且严重，如不能得到及时治疗，有很高的死亡风险。此外，最新研究表明，腺病毒载体新冠疫苗可能导致血小板数量减少，从而诱发血栓形成，增加了普通人群注射新冠疫苗后的健康风险。腹腔注射角叉菜胶能引起炎症反应，产生大量炎症因子和自由基释放到血液中，小鼠尾部的股动脉一旦栓塞，侧支循环困难，会使小鼠尾部组织形成血栓。因此，本研究使用角叉菜胶诱导小鼠尾部炎症，形成尾静脉血栓，以检验实验对象的抗血栓效果。
重庆第二师范学院 重庆市功能性食品协同创新中心的易若琨、刘 佳、赵 欣*等前期从传统自然发酵的四川泡菜中分离得到1 株发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）CQPC04（以下简称LFCQPC04），该课题组以角叉菜胶建立小鼠血栓形成模型，利用LF-CQPC04干预模型小鼠，通过测定小鼠凝血情况、氧化应激水平、炎症水平及肠道内容物菌群组成分析LF-CQPC04干预对小鼠血栓形成的影响，探索LFCQPC04在预防和清除血栓形成方面的效果。在临床上常使用药物肝素对易栓症患者进行治疗，因此，本研究选择肝素作为阳性药物对照。
1、小鼠黑尾长度
6 周龄SPF级雄性昆明小鼠经7 d的适应性喂养后随机挑选50 只小鼠（体质量为（23±2）g）进行实验。小鼠被随机分为正常组、模型组、肝素组、低剂量LF-CQPC04（LF-CQPC04-L）组和高剂量LF-CQPC04（LF-CQPC04-H）组，每组10 只。
小鼠腹腔注射角叉菜胶后，除正常组外，其余各组小鼠尾尖逐步出现黑色区域，提示尾部形成血栓，造成黑尾（图1）。其中模型组小鼠的黑尾长度（（9.4±0.4）c m）明显长于其他组。LF-CQPC04-H组小鼠黑尾长度（（3.2±0.4）cm）与肝素组（（3.0±0.2）cm）相似，且无明显差异。而LF-CQPC04-H 组和肝素组的黑尾长度明显短于LF-CQPC03-L组（（7.8±0.5）cm）。
2、小鼠的APTT、TT、FIB质量浓度和PT
正常组小鼠APTT（（183.6±10.8）s）显著高于其他组（图2），TT（（22.6±2.9）s）、FIB质量浓度（（50.6±5.5）g/L）和PT（（4.5±0.6）s）则显著低于其他组（P＜0.05）。而模型组的APTT（（59.7±6.9）s）显著低于其他组，TT（（89.7±6.6）s）、FIB质量浓度（（122.6±11.3）g/L）、PT（（23.1±3.1）s）则显著高于其他组（P＜0.05）。LF-CQPC04-H组的APTT（（133.5±8.8）s）明显高于LF-CQPC04-L组（（91.3±4.6）s）；TT（（43.1±5.1）s）、FIB质量浓度（（71.6±6.7）g/L）、PT（（13.3±2.5）s）均显著低于LF-CQPC04-L组（P＜0.05）。LF-CQPC04-H组APTT、TT、FIB质量浓度、PT与肝素组相似，差异无统计学意义（P＞0.05）。
3、小鼠血清的SOD、CAT活力和MDA浓度
如图3 所示，正常组小鼠血清中的SOD（（420.06±30.35）U/mL）和CAT（（83.54±4.10）U/mL）活力显著高于其他组（P ＜0.05），MDA 浓度（（20.54±2.21）nmol/mL）显著低于其他组（P＜0.05）。肝素组和LF-CQPC04-H组的SOD、CAT活力低于正常组，但均显著高于LF-CQPC04-L组（P＜0.05）。模型组小鼠SOD活力（（177.89±18.97）U/mL）和CAT活力（（22.57±2.22）U/mL）显著低于其他组（P ＜0.05）。模型组MDA 浓度（（90.36±5.09）nmol/mL）最高，LF-CQPC04-L组MDA浓度显著低于模型组（P＜0.05），但显著高于肝素组和LF-CQPC04-H组（P＜0.05）。
4、小鼠血清的TNF-α、IL-6、NF-κB和IL-1β质量浓度
实验结果表明，正常组、肝素组、LF-CQPC04-H、LF-CQPC04-L和模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6、NF-κB和IL-1β质量浓度呈现出由低到高的趋势（图4）。其中，肝素组和LF-CQPC04-H组TNF-α、IL-6、NF-κB、IL-1β质量浓度显著低于LF-CQPC04-L组（P＜0.05），而与LF-CQPC04-H组之间无显著差异（P＞0.05）。
5、小鼠尾组织的病理学观察
小鼠尾组织染色切片结果如图5所示，正常组小鼠尾部血管圆润干净，血管壁光滑；模型组小鼠尾血管有炎性细胞渗出、出血性病变、血小板聚集且血管内有血栓（箭头处）形成；LF-CQPC04和肝素干预均能减轻小鼠尾部血管的病变，其中LF-CQPC04-H和肝素的干预效果相似，且均优于LF-CQPC04-L。
6、小鼠结肠组织的相关mRNA相对表达水平
如图6所示，正常组小鼠结肠组织中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的mRNA相对表达水平最高，而模型组上述mRNA的相对表达水平最低。LF-CQPC04-H组和肝素组小鼠结肠组织中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的mRNA相对表达水平接近，且高于LF-CQPC04-L组。正常组小鼠结肠组织中NF-κB p65、IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA相对表达水平明显低于于其他组，而模型组上述mRNA相对表达水平则显著高于其他组（P＜0.05）。LF-CQPC04和肝素均能显著下调血栓小鼠结肠组织中NF-κB p65、IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA相对表达水平，其中LF-CQPC04-H与肝素的效果相似，两者的效果均显著优于LF-CQPC04-L（P＜0.05）。
7、小鼠尾静脉组织的相关mRNA相对表达水平
qPCR实验结果显示，模型组小鼠尾静脉血管中NF-κB p65、细胞间黏附分子（ICAM）-1、血管细胞黏附分子（VCAM）-1和E-选择素（E-selectin）的mRNA相对表达水平最高（图7）。LF-CQPC04-L、LF-CQPC04-H和肝素可显著下调血栓小鼠尾静脉血管中NF-κB p65、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的mRNA相对表达水平（P＜0.05）。同时，LF-CQPC04-H和肝素组小鼠上述mRNA相对表达水平没有显著差异（P＞0.05），且高于正常组。
8、小鼠肠道内容物菌群α-多样性分析结果
如表2所示，各组测序深度均高于0.999，说明测序深度已饱和，实验数据合理可用。其中Ace指数、Chao指数反映菌群总数，越高表明菌群丰富度越高；Shannon指数和Simpson指数能够反映菌群的多样性，较大的Shannon指数与较小的Simpson指数可以反映更高的菌群多样性。正常组、LF-CQPC04组和肝素组的Ace、Chao和Shannon指数均显著高于模型组，Simpson指数显著低于模型组，表明正常组、LFCQPC04组和肝素组小鼠粪便中菌群的丰度和多样性更高。并且除Simpson指数外，不同剂量LF-CQPC04组间的菌群丰度和多样性存在明显差异，LF-CQPC04-H组的菌群丰度和多样性高于LF-CQPC04-L组。同时，LFCQPC04-H组Ace、Chao和Shannon指数均高于正常组和阳性对照肝素组，Simpson指数低于正常组和阳性对照肝素组，提示在灌胃高剂量LF-CQPC04后，小鼠肠道内容物菌群丰度和多样性显著上升。
9、小鼠肠道内容物菌群β-多样性
如图8所示，通过ANOSIM法进行组间差异检验后发现，不同组别的物种组成存在显著性差异（R 2 ＝0.4148，P＝0.001）。其中与模型组相比，正常组、LF-CQPC04干预组和肝素组的肠道菌群组成结构均发生了偏移，而LF-CQPC04干预组与正常组的物种组成具有一定的相似性，并且LF-CQPC04-H组与正常组物种组成最为接近，LF-CQPC04-H组在调节小鼠肠道菌群方面效果较为显著。
10、小鼠肠道内容物菌群组成
如图9所示，5 组菌群组成在门水平上以拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）2 个菌门为主。其中，正常组中厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度比值（F/B）为1.28。与模型组相比，LF-CQPC04干预后F/B明显下降，LF-CQPC04-L组F/B为0.82，LF-CQPC04-H组F/B为0.78，阳性对照肝素组F/B为0.40，各组存在明显差异。并且与LF-CQPC04-L组相比，LF-CQPC04-H组F/B更低。
属水平上的物种相对丰度如图10 所示。正常组主要由norank_f_Muribaculaceae（22.07%）、Lachnospiraceae NK4A136（12.37%）、Bacteroides（11.05%）、unclassified_f__Lachnospiraceae（8.20%）和Lactobacillus（7.18%）构成。模型组中的菌群主要包含Candidatus_Arthromitus（63.13%）、Lactobacillus（17.88%）、Bacillus（11.33%）等。肝素组中菌群包含norank_f_Muribaculaceae（39.86%）、Bacteroides（12.17%）、Lactobacillus（5.92%）。LF-CQPC04组中菌群主要包含norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus、Bacteroides、Lachnospiraceae NK4A136、unclassified_f__Lachnospiraceae，与正常组的菌群构成最为相似。
结论
结果表明，LF-CQPC04能有效调节小鼠的凝血功能、血清和组织中的氧化应激和炎症水平。肠道菌群分析结果表明LF-CQPC04可以调节血栓小鼠肠道微生物组成，可能通过增加有益菌相对丰度促进肠道健康，改善血栓造成的肠道菌群失调。但是，LF-CQPC04进一步的应用需要开展临床研究和人体实验。
通信作者简介
赵欣，教授（三级），正高级工程师，硕士生导师，重庆第二师范学院儿童营养与健康发展协同创新中心主任。重庆市高校创新团队带头人，重庆市高等学校青年骨干教师，中国食品药品企业质量安全促进会区块链委员会专家委员，重庆市食品药品安全教育研究会常务理事，重庆市营养学会第四届理事会营养分析与保健食品专业委员会委员，SCI期刊BIOCELL编委。成果获2021年中国乳制品工业协会技术发明一等奖（益生菌资源的发掘和在发酵乳制品中的应用及产业化）；第四届长城食品安全科学技术奖一等奖（益生菌生物活性作用的研究及高品质产品创新开发与产业化）；2021年中国商业联合会科学技术奖全国商业科技进步奖一等奖（功能性发酵乳饮料生产关键技术创新与应用）等。
第一作者简介
易若琨，副教授，重庆第二师范学院儿童营养与健康发展协同创新中心办公室主任，重庆市农产品加工业协会技术专家委员会委员，重庆市食品药品安全教育研究会理事。主要研究方向为传统发酵食品中的益生菌及其功能性。以第一作者发表SCI期刊论文13篇，EI期刊论文3篇，出版学术专著2部。
本文《发酵乳杆菌CQPC04减轻小鼠血栓形成和调节肠道菌群的效果》来源于《食品科学》2023年44卷1期149-159页，作者：易若琨，刘佳，冯霞，赵欣。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220209-035。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
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