副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛分布于河口、海洋和沿海水域，也是全球范围内引起海产品相关肠胃炎的主要致病菌。副溶血性弧菌感染多与食品安全有关，多发生在夏季，经常能从鱼、虾、扇贝等海产品中分离出来。
研究表明，副溶血性弧菌能形成生物被膜，且一旦形成很难清除。细菌群体感应、外毒素、IV型分泌系统和鞭毛系统等与生物被膜的形成密切相关。生物被膜是由自身细菌分泌基质聚合物包裹的微生物群，它能够定植在生物和非生物表面。被包裹的细菌能自己产生胞外聚合物（EPS），如胞外多糖、胞外蛋白、脂质和核酸。生物被膜的存在给公共卫生带来了极大的挑战，其原因是生物被膜通过EPS的作用保护菌体免受不良环境的侵害，生物被膜的存在能增强菌体抵抗紫外线、抗生素和其他外部压力高度耐受的能力。
为了解细菌在生物被膜动态形成过程中基因表达的变化与生物被膜之间的关系，研究2 株生物被膜差异菌株的生理生化特性，并在此基础上对生物被膜形成前期和后期的生被膜菌进行转录组测序。安徽工程大学生物与食品工程学院的李安琪、王 洲*等结果将有助于丰富副溶血性弧菌生物被膜形成机制研究，为生物被膜防控提供一定理论支撑。
1、生物被膜形成趋势
由图1A可知，实验所涉及的6 株供试菌株生物被膜的形成均先增加后减少，再增加到峰值又减少的趋势。可以基本判定0～12 h为可逆黏附阶段，12～48 h为不可逆黏附和微菌落形成阶段，48～72 h为成熟阶段，72～144 h为解离阶段。由图1B可知，生物被膜成熟期72 h时菌株ATCC 17802的成膜能力强于VP-0，且随着培养时间延长生物被膜开始解离，这与图1C结晶紫染色后的结果一致。副溶血性弧菌ATCC 17802和VP-0具有相似的成膜趋势，且静置培养72 h的成膜能力显著强于（P＜0.05）其他菌株，可以作为后续研究材料。
2、信号分子AI-2检测结果
如图2所示，随着生物被膜的培养，两株被膜形成差异菌株的信号分子AI-2呈上升趋势，并且在72 h被膜成熟期达到最大值，生物被膜进入解离期时，AI-2浓度有所下降，这与生物被膜形成量趋势相一致（图1）。两株被膜差异菌株在信号分子AI-2在含量上没有显著差异。研究发现，AI-2能促进大肠杆菌和变形链球菌的生物被膜形成。同样地，在本实验中两株菌生物被膜的形成趋势与各自AI-2变化趋势基本一致。
3、EPS分析
由图3可知，在本实验中，随着生物被膜的成熟，胞外多糖和胞外蛋白逐渐增多，并在被膜成熟期48～72 h含量迅速增加。此时ATCC 17802的胞外多糖和蛋白含量分别是VP-0的1.67 倍和2.3 倍。之后随着生物被膜的分解，两株供试菌胞外多糖和蛋白的含量均开始下降。由此可知，EPS的产生在生物被膜的成熟阶段起着最重要的作用。
4、细胞膜渗透性
从图4可知，细胞膜的渗透性也发生改变，处在生物被膜形成期时（8、48、72 h）的两株供试菌株的细胞膜渗透性，均高于生物被膜解离期（96 h）。在生物被膜解离期细菌分泌EPS减少且部分细菌处于休眠状态，也因此细胞膜渗透性处于较低水平。在生物被膜形成期（8、48、72 h）成膜能力较强的ATCC 17802细胞渗透性高于成膜能力较弱的菌株VP-0。这也说明渗透性对生物被膜的形成具有重要作用，在生物被膜成熟期0～72 h保持较高的渗透性。
5、CLSM观察
副溶血性弧菌ATCC 17802和VP-0形成成熟生物被膜的CLSM如图5所示。可以看出，在48 h（图5A、B）成膜能力强的菌株ATCC 17802细菌较VP-0呈现更集聚集的状态。在成熟期（48～72 h）有大量菌体聚集分泌多糖和蛋白，并被胞外分泌物质包裹其中，抗逆性增强。随着生物被膜的解离，到96 h（图5C、D）时生物量有所减少，多糖和蛋白含量也随之减少。这与对生物被膜含量的检测结果相似，也进一步表明在生物被膜形成过程中，成膜能力强的菌株ATCC 17802黏附在介质表面的能力强于VP-0。
6、转录组分析
转录组数据质量分析
对93962274 条原始测序reads进行过滤，得到高质量有效reads共92506128 条（表1）。6 组样本的碱基测序精确度Q30值均达到95%以上，GC含量超过46%，说明测序错误较少且质量较高，可进行下一步分析。将转录组数据上传至NCBI数据库，登记号为PRJNA784512。
差异表达基因筛选及表达聚类分析
分别从48 h vs 8 h、72 h vs 8 h比较组中，筛选得到1061 个和802 个差异表达基因（P＜0.05，|log2Fold Change|≥1），以静置培养8 h样本为对照时，48 h样本和72 h样本中，ATCC 17802基因表达上调分别为406 个和296 个，表达下调数量分别为655 个和606 个。72 h样本和48 h样本比较，差异表达基因共267 个，其中表达上调基因171 个，表达下调基因96 个（图6A）。结果表明，生物被膜成熟期（72 h和48 h）与生物被膜形成黏附期（8 h）相比较存在较大的基因差异，生物被膜形成受多种基因调控。
图6B表示差异基因FPKM（fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced）归一化后的数值。可知RNA-Seq数据良好，3 个时间段基因表达差异明显，可进行后续基因注释分析。
生物被膜形成阶段差异基因的GO功能注释
将筛选到的差异基因注释到GO数据库，有助于对基因功能进行挖掘。GO富集分析以P＜0.05、|log2Fold Change|≥1作为标准，将生物被膜形成前期（48 h vs 8 h）比较组的差异基因分别注释到生物学过程、细胞组分以及分子功能3 个大类（图7A）。48 h vs 8 h处理组注释差异基因到3 个大类，32 个亚类，在生物过程中注释的条目最多，其中涉及翻译、多组织过程、肽的合成、细胞酰胺代谢过程、ATP代谢过程、有机氮化合物生物合成过程和跨膜运输，多数表现基因下调；在细胞组分类别下，主要涉及细胞内的细胞质、细胞器以及核蛋白复合物，表现较多的差异基因，且多为下调；在分子功能类别中，核糖体结构成分、结构分子活性、质子跨膜转运蛋白活性、氧化还原酶活性等条目下表达差异基因数量较多，并表现基因下调特性。
由图7B可知，72 h与48 h处理组比较，注释差异基因到3 个大类，14 个亚类，在生物过程类别中，氧化还原过程、α-氨基酸代谢过程、应激响应过程、蛋白质折叠、细胞稳态、种间互作等表现显著差异；在细胞组分类别中，仅外膜表现显著差异；而在分子功能类别中，丝氨酸型内肽酶活性、氧化还原酶活性、磷酸转移酶活性、羧酸酯水解酶活性等表现显著差异。
生物被膜形成阶段差异基因的KEGG代谢通路分析
结果如图8所示，分别以通路基因比值、富集基因数目、P值为指标，进行相关代谢通路的分析。在48 h与8 h处理组比较中，差异基因主要参与了核糖体、细菌分泌系统、氧化磷酸化、次级代谢产物的生物合成、不同环境下的微生物代谢、碳代谢等相关通路，共涉及22 种代谢通路；在72 h与48 h处理组的比较中，差异基因主要参与乙醛酸和二羧酸代谢、不同环境下的微生物代谢、碳代谢、丙酮酸盐代谢、脂肪酸代谢、ABC转运蛋白、群体感应等通路，共涉及22 种代谢通路。
7、生物被膜相关差异基因挖掘
为深入挖掘与生物被膜相关差异基因的变化，了解生物被膜动态形成过程中的差异，对富集的差异基因进行分析。FPKM是目前常用的基因表达水平估算方法。基因表达量以FPKM表示，结果如表2所示。
8、能量代谢相关差异基因挖掘
糖酵解途径能将葡萄糖分解为两分子丙酮酸并提供能量，此过程分为准备阶段和放能阶段两个部分。在生物被膜形成过程中，准备阶段的磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶和放能阶段的磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶均有一致变化，在可逆黏附（8 h）到生物被膜成熟前期（48 h）过程中，上述基因上调；在生物被膜成熟后期（72 h），上述基因表达下调（表3）。
在胞浆进行的戊糖磷酸途径能通过氧化葡萄糖得到6 分子CO 2 和12 单位强还原力的NADPH，其限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因在可逆黏附（8 h）到生物被膜成熟前期（48 h）过程中，基因上调，在生物被膜成熟后期（72 h）基因表达下调（表3）。
9、鞭毛合成相关差异基因挖掘
如表4所示，在可逆黏附（8 h）到生物被膜成熟前期（48 h）过程中，鞭毛组装蛋白合成普遍下调，其中鞭毛反σ因子（flgM）表达量有所增加，鞭毛调控蛋白FlgM对鞭毛转录的2级和3级操纵子起到负调控作用，这些直接导致菌体运动能力减弱。
10、转运相关差异基因挖掘
转运蛋白大量存在于原核生物中，能借助ATP释放的能量协助多种物质进出细胞。对生物被膜菌形成过程中转运蛋白进行分析，表5展示了主要差异蛋白基因：麦芽糖转运蛋白（malK、malE、malF、malG）、精氨酸转运蛋白（artM、artQ、artP）和寡肽转运蛋白（oppB、oppC、oppD、oppF）。
结论
综上所述，在可逆黏附期（8 h）阶段，副溶血性弧菌通过AI-2的合成与累积，调节一系列级联反应。进入生物被膜成熟前期（48 h），其代谢增加，运动能力减弱，转运蛋白编码基因上调，EPS分泌增加；在生物被膜成熟后期（72 h），细菌代谢减少，寡肽转运蛋白基因下调，耐药性增加。这些研究结果为生物被膜形成机制的研究提供了一定理论支持。
01
通信作者简介
王洲，博士，安徽工程大学生物与食品工程学院副教授，硕士生导师。毕业于江南大学发酵工程专业，目前任职于安徽工程大学生物与食品工程学院。长期从事微生物生理与生化、食源性病原微生物致病机制及防控策略研究。主持或完成国家自然科学基金项目、安徽高校自然科学研究项目、糖化学与生物技术教育部重点实验室开放课题等项目多项，在相关研究领域发表学术论文10余篇。
第一作者简介
02
李安琪，女，硕士研究生。就读于安徽工程大学微生物学专业，研究方向为微生物资源与育种。在Microbial Pathogenesis以第一作者发表食源性病原微生物致病机制相关文章一篇。
本文《副溶血性弧菌生物被膜动态形成机制的转录组分析》来源于《食品科学》2023年44卷2期146-155页，作者：李安琪，石成龙，钱森和，王洲，赵世光，刘艳，薛正莲。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220224-208。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
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