“我们成功解析了人源 ATP 合成酶结构，这将助力于开发抗肿瘤药物和靶向性更强的抗结核药物。 想到本研究成果不仅能加速靶向人源 ATP 合成酶的抗肿瘤药物研发，还可以为优化贝达喹啉这一抗结核药物提供指导，我和合作者就对这一研究成果感到自豪。”南开大学教授表示。

图 | 贡红日（来源：）

近日，他和合作者成功解析了人源 ATP 合成酶结构，这能为研究相关疾病以及药物研发提供直接的模型参考。

此外， 他们还解析了人源 ATP 合成酶的多种旋转状态的高分辨率结构，并对其旋转催化机制提出新见解，为经典催化机制带来了补充和扩展。 ‍‍‍‍

同时，针对此前颇具争议的跨膜区域的质子转运机制，此次解析的高分辨率的结构提供了直接的证据证实：内外通道的质子转运，都是借助格罗特斯机制来完成的。

同时，人源 ATP 合成酶结构的解析，不仅是整个 ATP 合成酶领域重要进展，也是对于氧化磷酸化系统运转机制的关键补充之一。

在肿瘤代谢研究与临床药物研发中，能量代谢一直是广受关注的领域。因此，靶向氧化磷酸化系统的药物发现，也将为肿瘤药物研发带来新方向。

最近，靶向氧化磷酸化系统复合物 I 的抑制剂 IACS-010759，在临床试验中未能取得预期效果，甚至给靶向肿瘤代谢药物的研发蒙上一层阴影。然而，结合氧化磷酸化系统蛋白复合物功能缺陷致病的临床数据、以及 ATP 合酶在该系统中扮演的角色分工来看，对于靶向人源 ATP 合成酶的抗肿瘤药物开发，持乐观积极的态度。

此前已有报道指出，大环内酯类药物 apoptolidin A 通过靶向抑制剂 ATP 合成酶，在杀伤白血病细胞时展现出良好效果。

另有研究发现 ATP 合成酶可以控制线虫和苍蝇的衰老。也有研究发现 J-147 小分子化合物通过调节 ATP 合成酶的活性，可以成功逆转小鼠痴呆症的病情，目前已经进入临床人体试验评估阶段。

而在本次研究中，研究团队提供了关于人源 ATP 合成酶的纯化方法以及三维结构信息并已申请专利，预计能够助力新型小分子候选药物的筛选。

课题组发现对于人源 ATP 合成酶来说，一些基于靶向细菌 ATP 合成酶的抗菌药物也能起到抑制作用，比如前面提到的药物贝达喹啉，它能靶向结核分枝杆菌 ATP 合成酶。

但是团队最近发现，该药物也能对人类 ATP 合成酶产生抑制活性，这就意味着患者在服用抗感染药物的同时，会给自身的健康带来潜在隐患。

而此次针对人源 ATP 合成酶结构的解析，则能为优化贝达喹啉、以及开发新一代抗感染靶向药物提供理论指导，也能为设计靶向细菌源 ATP 合成酶抗菌药物奠定基础。

三个契机：从诺奖、到抗结核药、再到抗肿瘤药

那么，该研究团队开展本次研究的深层原因还有哪些？这就得从真核哺乳动物氧化磷酸化系统说起。

上述系统主要包含 4 个呼吸链蛋白复合物（I-IV）和 ATP 合成酶（亦称为复合物 V）。研究团队之所以开展人源 ATP 合成酶的研究，也是鉴于以下几个契机：

其一， ATP 合成酶自身的重要性。1997 年，美国生物化学家保罗·波耶尔（Paul D. Boyer）和英国化学家约翰·沃克（），凭借阐 明腺苷三磷酸（ATP ，adenosine triphosphate）合成的基本酶学机制而被授予诺贝尔化学奖。此后，有关细菌、真菌和动物 ATP 合成酶的结构功能研究愈加深入。但是，人源 ATP 合成酶的三维结构一直未被解析，这极大限制了我们对于人源 ATP 合成酶运转机制的直观认识。

其二，作为最近五十多年以来第一个被批准的抗结核新药，贝达喹啉通过靶向结核分枝杆菌 ATP 合成酶来起到杀死结核分枝杆菌的作用。然而，如前所述贝达喹啉对于人源 ATP 合成酶也存在抑制活性，这会对长期服用贝达喹啉的结核病患者带来潜在的毒副作用。

而该团队长期致力于研究结核分枝杆菌的氧化磷酸化系统结构功能以及新药研发，因此他们希望可以获取人源 ATP 合成酶的高分辨率三维结构，通过进一步优化贝达喹啉，进一步研发对于人体毒副作用更小的结核分枝杆菌 ATP 合成酶抑制剂。

其三，课题组始终密切关注靶向肿瘤细胞氧化磷酸化系统的抗肿瘤药物开发。他们发现部分癌症组织或肿瘤干细胞比如白血病细胞在供能的时候，高度依赖氧化磷酸化系统。而正常细胞则能通过底物水平磷酸化和氧化磷酸化这两种方式来实现供能。由此可见，ATP 合成酶有望成为极具前景的抗肿瘤药物靶点。基于以上这些因素，该团队对于人源 ATP 合成酶产生了极大的兴趣。

三个“有”：有耐心、有胆识、有信心

此前，对于临床 ATP 合成酶点突变致病机制的分析，人们往往都是参考其他物种的同源结构。需要注意的是，人源 ATP 合成酶亚基氨基酸序列与同源结构，并不存百分百的一致性。

然而，启动本次课题的时候，文献报道的只有人源呼吸链复合物 I、III、IV 的三维结构信息，人源 ATP 合成酶和琥珀酸脱氢酶（呼吸链复合物 II）的三维结构信息仍然是一片空白。

同时，这两个蛋白复合物也比较特殊：一个是 ATP 的直接“制造者”，一个则能同时连接三羧酸循环和氧化磷酸化系统。

基于之前的研究经验，他们打算先着手攻关人源 ATP 合成酶的结构解析工作。“这里提一下，我们也几乎同步开展了人源呼吸链复合物 II 三维结构信息的解析工作，相关论文已于今年发表在 PNAS 上。”说。

而在本次 Molecular Cell 论文的研究中，他们遇到的第一个难题便是如何提纯人源 ATP 合成酶蛋白样品。

“在提纯方式上，我们并没有直接可以参考的文献，不然人源 ATP 合成酶结构早就被解析了。此外，需要指出的是我们先前做的一直是原核蛋白表达纯化，这意味着需要从头摸索提取线粒体、进而纯化目的蛋白的实验方案。”说。

为此，他们几乎尝试了已有文献提到的所有线粒体纯化方法，通过不断调整实验参数，才发现了目前来看最简单、最有效的线粒体提取方法。

在人源 ATP 合成酶蛋白纯化阶段，由于没有亲和纯化标签，他们只能一边进行纯化实验、一边开展表征目的蛋白的实验，以便不断缩小目的蛋白存在的区间，进而获取高纯度的目的蛋白。

起初，他们试图利用阴离子交换的方法，根据蛋白质的带电性不同来将目的蛋白分离出来。但是，耗时数月之久分离效果依旧不够理想，此次课题也被迫暂停。

那时，开展课题的学生已经开始研究新的课题。“庆幸的是学生在开展新课题时找到了一些灵感。于是，这名学生折返回来继续尝试人源 ATP 合成酶蛋白的提纯。”他说。

一个月时间匆匆过去，仍然没有获取理想的蛋白样品，角蛋白污染的问题也依然存在。

再后来，这名学生抱着试一试的态度，使用了阳离子交换层析。“这一小小的举动带来的蛋白纯化效果是超乎预料的。最终，经过进一步优化之后，学生终于拿到了可以满足后续实验的高纯度人源 ATP 合成酶蛋白。”说。

回头来看，这并不是“增加一个纯化柱子进行再组合”的简单之举，对于学生来说更是一次思维的创新。

随后，课题组借助单颗粒冷冻电镜技术，来解析人源 ATP 合成酶结构。在制样过程之中，他们尝试过各种载网、去垢剂和添加剂，解决了蛋白不进孔、取向优势、蛋白聚集等问题。

而在数据解析时，通过摸索合适的三维分类方法、以及局部细化方法，他们将整体分辨率和局部分辨率都推至近原子高分辨率，借此解析了基于人源 ATP 合成酶的四种高分辨率三维结构。

对于论文投稿过程则表示：“这个过程需要我们有耐心、有胆识、更要有信心。由于投稿时间跨度长，并且前后经历多份期刊的评审，我们非常担心研究方案被泄漏，也很担心被国际同行抢发。但是，我们并未因此降低期望值，还是要争取发在有影响力的期刊上。”

随着数据质量的不断提升，最终相关论文以《人 ATP 合酶的结构》（）为题发在 Molecular Cell 上，赖越峥、张玉莹、周珊、徐金旭和杜占强是共同一作，南开大学教授、中科院院士、上海科技大学副研究员、广州实验室副研究员担任共同通讯作者 [1]。

审稿人也给予了“此次成果将对 ATP 合成酶领域产生重要影响”的高度评价。此外，该研究被列为世界学术组织 Faculty Opinions 推荐论文，并由日本京都产业大学横山健（）教授进行点评。他指出，该研究获取的结构信息将为靶向 ATP 合成酶的药物开发提供有价值的资料 [2]。

Faculty Opinions（原 F1000Prime，于 2020 年 4 月 12 日改名为 Faculty Opinions）是国际生物医学领域重要的学术论文评估机构，由全球近 8000 名生物学和医学领域的顶尖科学家组成。“Faculty Opinions”中的科学家从每年所发表的生物医学论文中评选出一小部分（不足千分之二）创新性强且具有重要理论价值和应用前景的文章，推荐给全世界的生物学和医 学工作者，并对论文加以评论。“此次论文能被 Faculty Opinions 点评与收录，代表着该论文有较高的学术水平和重要的科学价值。”表示。

图 | 相关论文（来源：Molecular Cell）

毫无疑问的是，作为抗肿瘤药物的靶点，人源 ATP 合成酶具有令人期待的应用前景。

近年来，该实验室也在围绕人源 ATP 合成酶开展药物研究。不同于以往在细胞水平筛选小分子化合物，然后再寻找作用靶点的研究思路，该团队基于提纯目的蛋白、以及结构解析上的先发优势，采取了先在蛋白水平进行化合物筛选，再去设计药物的研究思路。

目前，课题组已经设计和筛选出一种先导化合物，它能对白血病细胞和胰腺导管癌细胞展现出良好的杀伤效果，未来几年有望进入临床试验。

“我也是从农村出来的”

与此同时，课题组也在研究农作物病虫害。农作物病虫害是中国的主要农业灾害之一，它具有种类多、影响大、时常暴发成灾的特点，其发生范围和严重程度会对国民经济、特别是农业生产常造成重大损失。

琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂，是近年来非常热门的杀菌剂。在防治谷物病害方面起着重要作用，它可以有效防治小麦叶枯病、小麦叶锈病或大麦云纹病等大多数谷物重要病害，故其市场规模一直以每年 30% 左右的速度在增长。

“另外，我也是从农村出来的，而且本硕学的都是涉农专业，因此对于病虫害有着更深刻的认识。巧合的是，我们实验室一直专注于氧化磷酸化系统的功能机制及其新药的研发，而且我们在琥珀酸脱氢酶的结构研究上更是走在了世界前沿。”说。

此前，该团队已经提纯了人源琥珀酸脱氢酶，并已针对其三维结构进行解析。更早之前，他们还研究了土壤细菌耻垢分枝杆菌琥珀酸脱氢酶的结构功能机制，相关论文分别发在 PNAS 和 Nature Communications。

在这些积累之上，课题组希望能够解决农药业的一些实际问题，比如琥珀酸脱氢酶抑制剂耐药性等问题，助力开发新一代绿色、高效的琥珀酸脱氢酶抑制剂， 以及研究基于靶向氧化磷酸化系统中的蛋白复合物的新型农药，从而为建设农业强国贡献智慧。

参考资料：

1.Lai, Y., Zhang, Y., Zhou, S., Xu, J., Du, Z., Feng, Z., ... & Gong, H.（2023）. Structure of the human ATP synthase.Molecular Cell, 83（12）, 2137-2147.

2.https://doi.org/10.3410/f.742663494.793599058

运营/排版：何晨龙

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