加快肿瘤药物研发，“N-of-1”临床试验设计了解一下！|临床试验|治疗|癌症患者|肿瘤

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精准肿瘤学时代，明确基因组改变和/或免疫易感性并设计针对它们的药物，从而有效联系实验室和临床。同时，新型疗法获批率的提高以及NGS（二代测序）成本的不断下降，加速了这种变化。此外，越来越多新靶点的发现，以及生物标记物的完善，为药物研发提供了更多途径。

在这种情况下也提出了新的问题，即当前评估新型抗肿瘤药物疗效的工具，是否符合预期的临床期望。传统的药物研发框架有很大的滞后性，需要新的试验设计来快速跟踪药物开发。N-of-1试验作为一种有前景的工具出现。

· N-of-1试验

N-of-1是一种研究设计，单个患者是分析单位，并作为他或她自己的对照。这种研究设计最初主要在慢性病研究中获得成功，包含患者主观的报告结果。传统N-of-1设计中，患者通常按照顺序，接受不同的治疗方案或安慰剂，其间可有一个洗脱期。这种个体的内在比较，克服了经典临床试验设计中受试者间的异质性。N-of-1试验可以像经典试验方法一样随机或盲法进行。

1986年，统计学家Gordon教授团队在NEJM发表文献（上图），引入N-of-1试验的理念，并以单个哮喘患者的治疗为例进行了介绍。个体患者的随机对照试验，通过在治疗期间按计划改变患者的疾病管理，旨在明确个体患者对治疗方案的有效性。这种设计被称为“密集研究设计”（intensive research design）、“单个病例试验”（single case experiment）、以及“N-of-1”研究（N是样本量的缩写）。

在N-of-1试验中，患者在一个时间段内接受一对（pair）治疗，一为活性药物治疗，另一为安慰剂或另一种治疗。每一对治疗方案的顺序随机化决定，患者和临床医生对实际接受的治疗保持盲态。这种方法其实是交叉（crossover）设计的一个例子。N-of-1随机对照试验和传统试验的主要区别，与其说是在设计上，不如说是在主要目的上：传统试验旨在明确对一组患者的总体治疗效果，而N-of-1旨在明确治疗对某一特定患者是否有益。

举一个实例。有一名65岁哮喘控制不佳的患者，主要症状为简单日常活动下（例如：洗澡或穿衣）就出现明显的呼吸短促，夜间多次醒来，休息状态下也能出现周期性的呼吸困难。几个月内，他的治疗方案不断调整，直到接受沙丁胺醇+茶碱+异丙托溴铵+强的松后，症状得到缓解。但是，患者本人和他的医生都对茶碱在其中发挥的作用感到质疑，与患者讨论后决定使用N-of-1随机对照试验来明确治疗效果。

每10天治疗期结束时，患者接受弯腰、快步走、上楼时呼吸困难程度的评估，日间是否需要使用沙丁胺醇，以及夜间对睡眠的影响。每个问题为7分制，7分代表最理想，1分代表症状严重，即得分越高越好。

评分结果显示（上图），在完成一对治疗的第一阶段，患者感觉更糟糕。揭盲后，的确在第一阶段都服用了药物，而第二阶段使用了安慰剂。停药后患者感觉症状改善，这提示茶碱可能由于夜间胃食管反流或肺误吸而加重症状。

· N-of-1试验在肿瘤学领域中

既往N-of-1试验设计在慢性病领域应用较多，例如阿尔兹海默症等。然而，在肿瘤学领域中，这种试验设计对于转移性肿瘤患者来说具有挑战性，甚至是不可行的。N-of-1试验设计的一个基本要求是，它们在慢性或稳定疾病中使用不同的治疗方法，并具有一定的疗效。此外，更换有效药物并给与一个洗脱期也存在伦理学问题。治疗应答评估是肿瘤学领域内使用N-of-1设计的另一个关键问题，因为不同的治疗方案和不同作用机制药物的应答时间可能不同。

尽管如此，N-of-1的理念仍然受到关注。目前的治疗方案大多是生物学驱动的，临床试验的传统设计可能缺乏及时转化为最新科学见解的能力。例如，经典的I期3+3剂量爬坡试验，可能需要较长的患者招募时间，尤其是针对罕见分子病变的靶向药物。此外，由于一些患者队列可能接受了较低的非治疗剂量，伦理方面的问题也出现了。重要的是，受试者间的异质性，很可能导致观察到的治疗应答和耐药的差异，这是经典设计无法解决的问题。因此，需要在药物开发过程中发展新的理念，以适应不断变化的精准肿瘤药物的需求。

图：单个患者中以药代动力学（PK）引导的实时剂量递增模型。

图：常规3+3试验设计允许根据当前队列中观察到的毒性特征而增加剂量。剂量的增加将在下一个剂量水平上进行测试，试验完成时间会延长。尽管所研究的药物具有生物学合理性，但部分患者的剂量仍不理想。

有学者将N-of-1试验设计模型进行了调整，并将模型应用在两名接受拉罗替尼治疗TRK融合阳性的肿瘤患者，这两名患者因G595R和G623R突变而对拉罗替尼产生获得性耐药。LOXO-195（selitrectinib）的临床前数据显示，其具有抗NTRK耐药突变的活性，故使用单个患者方案接受LOXO-195治疗。在实时药代动力学的指导下，患者接受预先制定的剂量递增方案，两名患者的耐受剂量为100 mg（bid），获得持续的临床和放射学缓解。同样的设计也应用在RET抑制剂（LOXO-292，selpercatinib）的开发中。值得注意的是，根据N-of-1试验得到的耐受剂量为160 mg，与后来进行的selpercatinib经典I期试验得出的耐受剂量相同。

· 定制化N-of-1试验

肿瘤学者们也在使用单个患者方案（single patient protocols）来评估新的抗肿瘤药物组合。例如，针对4例RET融合阳性NSCLC患者，他们之前接受过selpercatinib治疗，并因为MET依赖性耐药机制出现疾病进展，在selpercatinib的基础上联合克唑替尼（通过4个独立的N-of-1试验），4个患者均耐受性良好且获得临床治疗活性。另有一项研究，针对“off-target”获得性RET融合对EGFR抑制剂奥希替尼产生耐药的患者，探讨联合BLU-667（普拉替尼）的疗效，两名患者显示出快速的放射学缓解，提示选择性RET抑制剂和EGFR抑制剂联合使用可以克服对奥希替尼的继发性耐药。

由于耐药机制非常复杂，一种“one-size-fits-all”（通用）的方法可能无法满足不断增长的需求。随着靶向治疗的广泛应用以及治疗可能出现耐药机制的数量，使用传统临床试验设计来解决每种耐药机制可能是不现实的。

举个例子，虽然可以确定获得性耐药机制，但在许多情况下，可能为时已晚。一例接受selpercatinib治疗的RET融合阳性肺癌患者，在耐药肿瘤样本中检测到NTRK3融合（K8；N14）。研究者进行了临床前实验，提示KIF5B-RET和KHDRBS1-NTRK3共表达BaF3细胞对selpercatinib具有耐药性，用selpercatinib和larorectinib处理，可通过抑制ERK1/2和AKT活性从而诱导细胞凋亡，但是患者很快去世了。

在经典的试验设计中，这类患者可能需要数年时间才能参加联合疗法的I期试验。如果N-of-1是可行的，临床前证实的药物组合或可快速跟踪并在临床环境中进行评估，这可能有助于该患者和其他具有相同耐药机制的患者。N-of-1试验同样可以帮助一些罕见肿瘤类型的疗效数据，也为探索联合策略提供了机会。

· 分子标志物指导下的定制化N-of-1设计

有研究者实施了I-PREDICT研究（NCT02534675），对晚期肿瘤患者进行多种药物的个性化治疗和联合治疗。主方案允许不同癌症类型的患者接受不止一种分子匹配的治疗，根据他们的分子特征进行个体化治疗。该研究在初始治疗和既往接受过治疗的患者中都取得了成功的结果，引入了分子匹配概念和基于分子特征的联合治疗探索。在一项可能存在限制性毒性的试验中，双药组合中使用了每种药物常规剂量的50%，三药组合中使用了33%。然后，他们能够在患者个体内进行剂量递增，从而实时确定每种组合的适当剂量。

I-PREDICT研究实际上展示了个体化治疗评估的关键挑战：可行性。尽管N-of-1试验设计看起来很诱人，但大规模实施一直受到可行性和难以统计分析的阻碍。汇总统计数据确实可以在平均治疗效果之间产生组间比较。然而，这种方法通常受到设计异质性和应用治疗选择的限制。因此，如果没有一种标准化的方法来执行这些N-of-1研究，并考虑到试验设计的特点，结果将保持异质性且难以合并。I-PREDICT证明了在单一伞形方案下为患者设计多个N-of-1个性化治疗的可行性。

此外，液体活检可以动态监测变化。N-of-1试验可能成为评估新疗法的更灵活、更合适的工具。

· 从N-of-1试验中产生循证证据

从不同N-of-1试验中积累的数据实际上可以相加，以建立类似于I/II期设计的终点。例如，来自多个N-of-1试验的数据可用于确定推荐的II期剂量，甚至初步疗效。不同研究中不同患者的毒性情况也可用于了解可能的副作用和处理方法。随着N-of-1试验更加的标准化，产生的数据质量应该逐步提高，可以为临床证据提供依据。然而，同一肿瘤类型的患者之间存在差异，治疗应答和缓解持续时间可能是可变的，这就是开发新药临床疗效时需要对照组的理论基础，这在N-of-1试验中不存在。但是，患者仍然可以作为自己的对照，可以与患者上次和既往的治疗进行探索性比较。在这种情况下，N-of-1试验的无进展生存期（PFS）可以与先前治疗的PFS进行比较。这个计算类似于生长调节指数（growth modulation index，GMI）。GMI是在N-of-1试验用的时间与上次治疗用的时间之比。GMI＞1.33通常作为药物具有临床活性/疗效的指标。

其中一个问题是如何将N-of-1试验产生的证据放入现有的证据金字塔中。由于所提出的模型提供了一种前瞻性对照研究设计，患者作为自己的对照，因此将此类证据置于证据金字塔中比病例报告（case reports）、病例系列（case series）和病例对照研究（case-control studies）更高的位置是合理的（下图）。N-of-1试验的汇总数据可能会在证据金字塔中占据更高的位置，但随着研究设计的发展以适应肿瘤学日益增长的需求，这将仍然存在争议。

从N-of-1试验中产生证据的一个关键挑战是可能缺少报道阴性（negative）研究。这不仅仅是设计上的限制，而是一种发表偏倚。从不同的N-of-1试验中获取汇总分析也存在局限，但随着进一步的讨论和更广泛地接受开放数据共享，这种情况有望得到改善。

· 数字孪生（digital twin）

N-of-1试验，与经典III期临床试验中大样本量患者的临床应答不同，很难比较患者之间的差异。因此，分享这些N-of-1试验的数据将有助于获得临床证据，并可以在后续病例中加以利用。“数字孪生”可能可以解决。数字孪生指的是现实世界系统的虚拟表示，作为无法区分的对应物。就像雪花一样，每个肿瘤在分子水平上都是不同的。每个患者，即使有NTRK或RET融合，也有不同的共突变，在分子水平上是异质的“恶性雪花”。为“像我一样的患者”创建一个基于N-of-1试验的数字孪生系统，有可能进一步推动个性化精准医疗。共享来自N-of-1试验的匹配基因组和临床数据，将有可能找到过去接受过特定治疗患者的近乎精确的数据。实现这一目标的条件有两方面：1、研究人员愿意公开分享这些数据；2、确定应该使用哪些技术标准和生物信息学算法等进行匹配。

· 结束语

总体来说，N-of-1试验提供了一个特殊的机会，通过动态和快速的测试评估，将患者作为自己的对照，推进肿瘤药物的开发。传统的N-of-1设计可能不完全适合肿瘤学领域。但是，经过改进的N-of-1试验设计，与药物研发专家们的达成共识，这对于更好地评估新型抗肿瘤药物非常有用。大规模采用N-of-1试验前，药物监管部门的观点也是需要解决的一个重要方面。这些问题需要包括药物研发、早期试验、统计、监管和公共卫生方面的专家共同深入讨论。