维生素B6是一个重要的营养与广泛应用在医药、食品、饲料、化妆品等行业。吡哆醇(PN)是维生素B6最常见的商业形式，目前使用昂贵且有毒的化学物质进行化学合成。然而，天然酶的低催化效率和代谢途径的严格调控阻碍了微生物发酵生产PN。

2023年8月31日，中国科学院天津工业生物技术研究所张大伟及韩国科学技术院Sang Yup Lee共同通讯在Nature Communications发表题为“Protein engineering and iterative multimodule optimization for vitamin B6 production in Escherichia coli”的研究论文，该研究报告了一种用于PN生产的工程大肠杆菌菌株。执行平行途径工程以分离PN产生和细胞生长。

进一步合理设计了低效酶PdxA和PdxJ，以及初始酶Epd和Dxs。通过迭代多模块优化策略，最终菌株通过补料分批发酵生产1.4 g/L PN，产量达到29.16 mg/L/h。该研究的策略将有助于开发用于生产维生素和其他具有固有低代谢通量的生物制品的微生物菌株。

维生素B6由六种可相互转化的吡啶化合物组成，包括吡哆醇（PN）、吡哆胺（PM）、吡哆醛（PL）及其磷酸化衍生物、5'-磷酸吡哆醇（PNP）、5'-磷酸吡哆胺（PMP）和 5'-磷酸吡哆醛（PLP）。植物和微生物具有维生素B6的天然从头生物合成途径，但人和动物必须从膳食补充剂或饲料添加剂中外部获得。因此，维生素B6补充日粮在制药、食品工业和牲畜饲料中具有很高的商业价值。肠道只吸收非磷酸化的B6维生素，这些维生素被特定的酶转化为有活性的PLP形式。

盐酸PN是维生素B6最常见的商业形式，目前是通过完全化学合成的方式生产。该化学过程使用了太多的溶剂，此外，高温和氯化反应增加了安全风险。此外，国家环境保护监管已成为激励绿色技术创新的重要手段。鉴于这些因素，研究迫切需要一种基于发酵的维生素B6生产方法。维生素B6通过两种不同的途径从头生物合成，脱氧木酮糖5-磷酸（DXP）依赖性途径和DXP非依赖性途径。到目前为止，还没有发现同时具有维生素B6合成途径的生物体，但包括哺乳动物和人类在内的许多生物体都有一条维生素B6相互转化的补救途径。

生物合成维生素B6的尝试已经进行了50多年。最初，研究发现羊根瘤菌IFO14782在发酵168小时可以自然产生约100毫克/升的维生素B6。在另一项研究中，一种经过工程改造的大肠杆菌菌株在31 h23中过表达天然epd、pdxJ和dxs(编码DXP合酶)基因，产生了79 mg/L维生素B6(维生素的混合物)。不幸的是，这些都没有显示出足够高的效率来发酵生产维生素B6。

由于非dxp途径的PdxST 酶复合物效率较低，且难以通过合理设计加以改进，因此dxp依赖途径更适合于维生素B6的生产。通过比较大肠杆菌dxp依赖途径中酶的动力学性质和表达水平，研究发现维生素B6是由一系列“缓慢”酶产生的。关键酶Epd、PdxA和PdxJ周转数低，Km值高，且处于较低水平。此外，使用iML151527进行的计算机基因组规模代谢模拟表明，通过dxp依赖途径的低代谢通量。这些多种问题使提高维生素B61的滴度和产量具有挑战性。此外,基因工程细胞需要精致的代谢调节避免有毒中间4 HTP的积累,会损害生长。因此，为了开发高效的PN生产菌株，有必要解决上述挑战。

主要代谢途径与PN在大肠杆菌生物合成,代谢工程方法应用于过度生产PN和碳通量对PNP型从甘油丙三醇（图源自Nature Communications）

该研究报告了一种用于PN生产的工程大肠杆菌菌株。维生素B6的平行代谢途径工程进行生物合成途径以解耦细胞生长所需的PLP合成和PN产生。然后，进行序列和结构引导的蛋白质工程，以改善维生素B6生物合成途径的关键酶改造，包括起始酶Epd/Dxs和低效酶PdxA/PdxJ。随后，进行迭代多模块优化，结合基因，平衡上下模块的表达，最大限度地提高PN产量。最终设计的大肠杆菌菌株通过在5 L生物反应器中分批补料发酵产生 1.4 g/L 的 PN。综上所述，本研究为维生素B6的绿色生物生产及其未来的产业化奠定了坚实的基础。

参考消息：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-40928-0