琥珀酸（丁二酸， SA）是最具附加值的化学品之一，被广泛用于食品和饮料的添加剂，也在农产品和医药产品中具有多种应用。如今，为了减少对化石燃料的依赖，科学家们尝试利用微生物将植物生物质转化为生物基琥珀酸来取代石油基琥珀酸。
自 20世纪 90年代以来，通过代谢工程改造微生物来生产琥珀酸的研究不断，但都被“绊倒”在放大生产这一步。
模式酵母如酿酒酵母、大肠杆菌以及大多数生物体，需要在中性 pH 环境中才能生存。因此，当使用这些微生物生产琥珀酸时，需要添加大量碱来中和有毒的酸性条件，保持 pH 值接近中性（6 到 7 之间）。但这种操作会产生副产品，例如石膏或硫酸钙，因此必须在管线末端将其分离出来以纯化产品，从而提高了下游加工成本。
（来源：Nature Communications）
近日，先进生物能源和生物产品创新中心(CABBI)团队在Nature Communications期刊上报道了一种以甘蔗生产生物基琥珀酸的经济方法。研究人员通过代谢工程改造耐酸的非模式酵母——东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis），创建了一条高效的端到端的生产管线，避免了下游加工中的高成本步骤。CABBI 转化主题负责人、化学与生物分子工程(ChBE)教授赵惠民为本文通讯作者之一。
多年研究，代谢工程改造东方伊萨酵母生产琥珀酸
研究中使用的Issatchenkia orientalis酵母能够在低 pH 值（3 至 4）或酸性条件下茁壮生长。因为具有独特的耐酸性，I. orientalis也被认为是生产有机酸的“潜力选手”。然而，因为缺少基因操作策略，对于这种酵母的探索一度较为艰难。
赵惠民等人的研究也从早些年就开始了。
2020年 5 月，赵惠民作为通讯作者在Metabolic Engineering上发表论文，报道了团队开发的一套强大的三种新型遗传工具，能够促进目标基因表达的增加，并有助于从I. orientalis中生产有机酸等生物产品。
（来源：Metabolic Engineering）
这三个关键工具分别是：I. orientalis基因组中的功能性着丝粒 DNA（CEN）序列（用于稳定I. orientalis中的质粒复制）；一组组成型启动子和终止子（影响基因表达方式的 DNA 链的组成部分）；一种快速有效的在活的有机体内组装 DNA 的方法。
同年 12 月，在Metabolic Engineering Communications期刊上发表了题为“Genome-scale metabolic reconstruction of the non-model yeast Issatchenkia orientalis SD108 and its application to organic acids production”的论文，研究中开发了I. orientalis酵母的基因组规模代谢模型 SD108，涵盖 850个基因、1826 个反应和 1702 个代谢物，系统地评估了这种非模型酵母的代谢能力。赵惠民参与了这项研究。
（来源：Metabolic Engineering Communications）
2023 年 7 月，赵惠民等人在Metabolic Engineering期刊上报道了 I. orientalis 酵母中的多拷贝基因整合的着陆垫系统。这一高效的多拷贝集成工具，促进通过多重 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑构建大型、复杂的代谢途径。
基于前面的一系列工作，研究人员对I. orientalis酵母进行代谢工程改造，使其产生比酿酒酵母或大肠杆菌更高水平的琥珀酸。
总产率为64%，以放大300倍的中试规模批量发酵
在最新的研究中，通过代谢通量分析，研究人员确定了I. orientalis酵母代谢中限制琥珀酸产生的一个关键障碍：原生的I. orientalis酵母无法利用甘蔗中的蔗糖。因此添加了一种酶，可以将甘蔗汁中的蔗糖分解为葡萄糖和果糖，从而产生琥珀酸。再引入其他基因来过量生产琥珀酸。
图丨I. orientalis作为琥珀酸生产的工业平台（来源：Nature Communications）
在使用台式反应器进行喂料批量发酵时，工程菌株能在 pH 值为 3 的糖基培养基中以最高滴度生产琥珀酸，在最低培养基中为 109.5 克/升，在甘蔗汁培养基中为 104.6 克/升。
随后，该团队与 IBRL 的 Vijay Singh（通讯作者之一）团队合作，利用工业相关设备对工艺进行端到端集成，扩大了琥珀酸的生产规模。
在中试规模的发酵罐中以300倍的放大系数进行了批量发酵，使用甘蔗汁培养基获得了63.1 克/升的琥珀酸。下游处理包括两级真空蒸馏和结晶，可直接回收琥珀酸，无需进一步酸化发酵液，总产率为 64%。
最后一步是与 Jeremy S. Guest（通讯作者之一）合作，使用其团队开发的开源软件平台 BioSTEAM 来模拟完整的端到端、低 pH 值琥珀酸生产管线。技术经济分析(TEA)和生命周期评估表明，该工艺在经济上是可行的，并且相对于基于化石燃料的生产工艺，可以减少 34%至 90%的温室气体排放。此外，甘蔗本身生长也会吸收二氧化碳，可以进一步减少其碳足迹。
研究人员计划很快进一步扩大规模研究，以支持琥珀酸生产工艺的商业化。
除了琥珀酸，分离成本也是其他有机酸生产的瓶颈之一。
赵惠民表示，这条管线还可用于生产其他工业上重要的有机酸，包括 3-羟基丙酸(3-HP)。目前，用于一次性尿布和密封剂组件的 3-HP 市场超过 10亿美元。
论文第一作者也表示，希望I. orientalis能够作为生产多种有机酸的通用工业平台。
基于这项研究，研究人员已提交了一项关于I. orientalis酵母代谢工程生产琥珀酸的临时专利申请（US63/354、994、VGT 和 HZ）。
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