撰文 | 木兰之枻

CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用潜力严重受制于脱靶效应引发的安全风险。有研究者曾从gRNA和Cas9蛋白结构等多个方面探索脱靶发生的机制并加以改进（；；；）【1-4】。但总体而言，目前研究者对CRISPR-Cas9系统产生脱靶效应的机制认识仍不够全面，这不利于高效安全基因编辑技术的开发和优化。

近日，来自英国帝国理工学院的David S. Rueda实验室、阿斯利康的Maria Emanuela Cuomo实验室以及伦敦大学学院的Graeme A. King实验室合作，在Molecular Cell发表题为Negative DNA supercoiling induces genome-wide Cas9 off-target activity的论文。文章利用单分子光镊技术、CRICLE-seq全基因组脱靶分析策略以及细胞内的proxy-CRISPR和INDUCE-seq内源脱靶分析策略证实，DNA负超螺旋结构会提高Cas9对碱基错配的容忍度，最终在全基因组范围内增加Cas9的脱靶风险。

为分析DNA拓扑结构对Cas9脱靶的影响，研究者利用多通道微流体系统，结合光捕获的两个链酶亲和素化聚苯乙烯微球来拴住扭转约束的λ-DNA分子，随后通过光镊和共聚焦显微镜在单分子水平分析Cas9-tracrRNA-crRNA复合物编辑DNA靶位点的特异性。结果显示，λ-DNA处于松散/松弛状态时，Cas9在靶位点处的结合非常特异；而当λ-DNA处于超负螺旋状态时，Cas9会在多个脱靶位点处发生非特异性结合。后续分析指出，脱靶位点与靶位点间的序列相似性仍然是DNA超负螺旋导致Cas9脱靶位点增加的基础，而且脱靶位点数量与DNA超负螺旋呈正相关，即DNA超负螺旋结构增加会导致脱靶位点数量的增多。研究还发现，Cas9在脱靶位点结合频率及滞留时间的增加是导致脱靶位点数量增加的重要因素。此外，DNA遭受高强度拉伸而导致的张力增加也是导致Cas9脱靶位点数量增加的重要诱因且两者之间呈线性相关。总体而言，DNA负超螺旋结构会增加Cas9在脱靶位点的结合频率及滞留时间，最终导致Cas9特异性降低；此外，低程度的DNA负超螺旋便会导致Cas9特异性的显著下降，而且DNA张力增加会进一步降低其特异性，最终导致更为严重的脱靶风险。

除单分子光镊实验外，研究者还利用CIRCLE-seq在全基因组范围内分析Cas9的脱靶特征。结果显示，Cas9靶向特定的内源位点时（如EMX1-1），当DNA处于松弛状态，CIRCLE-seq可检测到的脱靶位点数为638；当DNA处于负超螺旋状态（促旋酶处理），CIRCLE-seq可检测到的脱靶位点数超过13000。后续分析指出，DNA负超螺旋会导致数量众多的脱靶位点，一方面是因为Cas9对错配容忍度的增加：负超螺旋状态下，>2000脱靶位点的错配碱基数多达6-7碱基。另一方面，DNA负超螺旋状态下，Cas9对脱靶位点错配碱基的位置和碱基错配的类型都有更高容忍度。研究者还对CIRCLE-seq检测到的多个脱靶位点进行了动力学分析。结果显示，在超负螺旋状态下，Cas9在不同脱靶位点处的动力学特征有明显差异。

除上述的体外实验外，研究者还开通过细胞内实验进一步验证了DNA负超螺旋结构对Cas9特异性的影响。研究者首先选用proxy-CRISPR策略开展研究。该策略设计两种sgRNA，靶位点的sgRNA和靶向邻近位置的短链sgRNA（14 nt，可引导Cas9结合，但不会导致双链切割），通过利用Cas9的两次结合来有效提升靶位点的切割效率。研究发现，proxy-CRISPR策略是通过增加靶位点的负超螺旋结构提升其编辑效率，而且当sgRNA与靶位点之间存在碱基错配时，proxy-CRISPR能显著提升其编辑效率。最后，研究者还利用INDUCE-seq对Cas9在细胞内的脱靶情况进行了系统分析。结果显示，胞内基因组DNA的确会出现负超螺旋结构并导致Cas9的脱靶风险增加。研究还指出，细胞内DNA负超螺旋结构的出现与基因转录相关，比如INDUCE-seq在分析EXM1-1所发现的脱靶位点中，超过70%都位于转录活化区域。

总体而言，研究者通过体外和细胞实验证实，DNA负超螺旋会显著降低Cas9基因编辑技术的特异性，从而导致脱靶位点数量明显增加。这一研究揭示了DNA拓扑结构改变导致Cas9产生脱靶效应的新机制，也为CRISPR-Cas9基因编辑系统的进一步优化提供了新的思路和方向。

参考文献

1. Kocak, D.D., Josephs, E.A., Bhandarkar, V. et al. Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures.Nat Biotechnol37, 657–666 (2019).

2. Choi, G.C.G., Zhou, P., Yuen, C.T.L. et al. Combinatorial mutagenesis en masse optimizes the genome editing activities of SpCas9.Nat Methods16, 722–730 (2019).

3. Bravo, J.P.K., Liu, MS., Hibshman, G.N. et al. Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9.Nature603, 343–347 (2022).

4. Pacesa, M. et al. Structural basis for Cas9 off-target activity.Cell185, 4067–4081.e4021 (2022).

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.09.008