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导读

压力导致的焦虑和抑郁高风险已成为全球日益关注的问题，而与压力相关的精神障碍往往伴有代谢功能障碍。虫草素是一种中草药，因其促进新陈代谢的作用而被广泛使用。

在本研究中，我们探究了不同剂量的虫草素在应激小鼠模型中的抗焦虑/抗抑郁作用，并评估虫草素在中枢-外周系统中的特定作用。双向肠-脑轴调节多种基本生理过程，包括认知和心理行为以及机体代谢。大量研究证实，肠道微生物群及其代谢物是影响肠-脑轴的关键调节因子，其功能障碍与多种精神疾病的病理特征有关，如焦虑、抑郁、以及代谢性疾病，如肥胖。本研究进一步探讨了虫草素对神经及代谢系统的整合调节作用。结果表明，12.5 mg/kg虫草素可降低抑郁小鼠应激激活的糖皮质激素系统活性，降低交感神经活动，改善抑郁相关的心理行为。25mg/kg虫草素可改善小鼠抑郁症相关代谢障碍，显著恢复因抑郁而减少的脂肪含量，包括内脏和皮下脂肪的含量。因此虫草素可以在伴有代谢障碍的抑郁症中发挥重要作用。此外，在治疗过程中，可以通过评估患者与抑郁症相关的精神和代谢障碍的严重程度来确定虫草素的给药剂量，以提高治疗效果，减少副作用，改善患者的生活质量。

论文ID

原名：Dose-Dependent Action of Cordycepin on the Microbiome-Gut-Brain-Adipose Axis in Mice Exposed to Stress

译名：虫草素对应激小鼠微生物组-肠-脑-脂肪轴的剂量依赖性作用

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

IF：7.5

发表时间：2023.10

通讯作者：刘欣安，陈祖昕

第一作者：景晓源，洪丰

通讯作者单位：中国科学院深圳先进技术研究院

实验设计

实验结果

1. 虫草素减轻了小鼠因压力应激引起的焦虑和抑郁样行为

我们进行了多种行为测试，以评估虫草素的抗焦虑和抗抑郁作用。t检验显示，与对照组相比，应激+水组在旷场测试中（OFT）的中心时间显著减少（图 1A），在黑白箱（LDB）测试中的潜伏期显著缩短（图 1C），在尾悬实验（TST）中的不动时间显著升高（图 1E），同时血清中的皮质酮（CORT）含量升高（图 1F）。无应激+25mg/kg虫草素组与对照组小鼠的行为指标无明显差异，这表明虫草素本身对小鼠的精神行为没有影响。进一步与应激+水组相比，应激+12.5mg/kg虫草素组的OFT 中间区停留时间、中间区移动距离/总距离和中间区进入次数（图 1A）；高架迷宫（EPM）实验中的开放臂停留时间和开臂进入次数（图 1B）以及黑白箱实验中的潜伏期均显著增加（图 1C）。应激+12.5mg/kg虫草素组和应激+25mg/kg虫草素组小鼠在 OFT 中的总移动距离均明显减少（图 1A）。

图1 虫草素对小鼠行为的改善和5-羟基吲哚乙酸的变化。(A）旷场实验中小鼠的运动轨迹、中心时间、总距离、中心距离/总距离和中心进入数；（B）高架实验中小鼠的运动轨迹、开臂时间、不动持续时间、开臂进入数和开臂距离；（C）黑白箱实验中的潜伏时间、光室时间和明暗转换；（D）Y迷宫实验中的自发交替和总臂进入数；（E）悬尾实验中的不动持续时间。(F）血清中CORT 的含量；粪便（G）、血清（H）和 PFC 样品（I）中5-羟基吲哚乙酸含量的变化。

2. 虫草素逆转压力应激诱导的脂肪组织流失及其与抗焦虑抑郁作用的相关性

应激+水组小鼠总白色脂肪组织（包括肾周白色脂肪组织（pWAT）、附睾白色脂肪组织（eWAT）和皮下白色脂肪组织（sWAT））的重量减少，而棕色脂肪组织（BAT）的重量增加。25 mg/kg虫草素对小鼠的体重（图 2A）和生长速度（图 2B）没有影响，但可以逆转应激引起的脂肪减少，尤其是 pWAT 和 sWAT 重量的减少（图 2C）。考虑到小鼠体重的差异会影响脂肪比较结果，我们用脂肪组织总重除以体重得出脂肪指数。结果发现应激会明显降低脂肪指数，而25mg/kg的虫草素能明显恢复下降的脂肪指数，这表明虫草素对脂肪代谢有保护作用（图 2D）。各部分脂肪重量在应激模型中均呈下降趋势，而在使用25mg/kg虫草素处理后则呈上升趋势（图2E）。25mg/kg虫草素能使脂肪组织/体重百分比显著恢复到接近对照组的水平（图2F）。具体来看内脏白色脂肪组织（vWAT）和 sWAT的重量（图 2G，图 2C）和百分比（图2H，图 2I）在应激模型中都有所下降，而在给予25 mg/kg 虫草素后则有所恢复。油红O染色结果（图 2J）表明，25 mg/kg虫草素可逆转应激小鼠脂肪细胞中脂肪滴的数量和面积减少（图 3K-3L）。对各组的旷场实验中心时间与体重增加率或脂肪指数的相关性分析的结果表明，中心时间与体重增加率呈显著正相关（图2M），与脂肪指数呈显著负相关（图 2N），表明虫草素对应激诱导的脂肪组织减少的逆转作用与其抗焦虑/抗抑郁作用具有协同效应。

图2 虫草素通过协同抗焦虑作用调节应激诱导的脂肪组织重塑。(A）虫草素对小鼠体重的影响；（B）小鼠的体重增长率；（C）不同组小鼠的脂肪组织重量。pWAT：肾周白色脂肪组织，eWAT：附睾白色脂肪组织，sWAT：皮下白色脂肪组织，BAT：棕色脂肪组织 (D)小鼠的脂肪指数；(E)整个WAT的重量和 (F)WAT重量/体重百分比；(G)内脏WAT（vWAT）的重量和(H)vWAT重量/体重百分比；(I)sWAT重量/体重百分比；(J)WAT的油红染色，标尺：25μm。(K)细胞大小；(L)脂肪滴的荧光强度。(M）OFT中心时间与体重增长率的线性相关分析；（N）OFT中心时间与脂肪率的线性相关分析。

3. 不同剂量虫草素逆转压力应激诱导的肠道微生物组成及血液代谢物的变化

为了探讨虫草素对应激后肠道菌群损伤的影响，我们采用16S rRNA测序方法分析了不同组的肠道微生物。α多样性分析显示，与应激+水组和应激+12. 5mg/kg虫草素组相比，应激+25mg/kg虫草素组的肠道微生物丰度显著提高(图3A)。应激+25mg/kg虫草素组和应激+水组的肠道微生物有显著差异。主坐标分析（PCoA）图（图3B）显示，应激+25mg/kg虫草素组和应激+水组肠道微生物群落聚类差异显著（Adonis, P < 0.05）。从图3C可以看出，四组中的肠道微生物在属水平主要包括Muribaculaceae、毛螺菌科菌（Lachnospiraceae）、普氏菌科细菌（Prevotellaceae）和梭菌（Clostridia），但微生物组成差异较大（图3D）。与应激+水组相比，应激+25mg/kg虫草素组Prevotellaceae_UCG-001丰度降低，而脱硫弧菌（Desulfovibrio）丰度增加；应激+12.5mg/kg虫草素组NK4A214_group丰度降低。（图3E-3G）其中NK4A214_group与焦虑有关，Prevotellaceae_UCG-001和脱硫弧菌与脂肪代谢有关。如图3H所示，g_Muribaculum和g_Marvintryantia在对照+水组中发挥重要作用；g_Prevotellaceae_UCG_001和g_Ruminococcus在应激+12.5mg/kg 虫草素组中起重要作用；g_Brevundimonas、g_Clade_III和g_thiioalbasispira_sulfurvermis在应激+25 mg/kg虫草素组中起重要作用，g_unculdis在应激+水组中起重要作用。

我们采用气相色谱-质谱法/液相色谱-质谱法(GC/LC)分析四组血清中代谢物的改变。首先，对各组间进行两两比较，确定各组间差异代谢物共有416种，其中50种代谢物在组间存在显著差异（图4A）。Venn图分析表明，各组间共同的差异代谢物为2-酮异戊酸、松柏苷、D-核糖、Behenoylglycine、精氨酸和TOFA（图4B）。应激+12.5 mg/kg虫草素组和应激+水组差异代谢物的前20条KEGG通路的气泡图如图4C所示。此外， 应激+25mg/kg虫草素和应激+水组之间差异代谢物的前20条KEGG通路如图4D所示。

图3 虫草素介导的肠道微生物群调节受应激影响。(A) 小鼠组间的多样性指数分析（ACE，Chao1，和观察到的物种）；(B)四组代谢物的 PCoA 图；(C) 分类等级为属的各种肠道微生物群的相对丰度；(D)显示肠道微生物属的物种组成的热图；(E-G)Prevotellaceae_UCG-001、NK4A214_group和脱硫弧菌的相对丰度；(H)基于Lefse的四个组间13个差异富集物种的支系图。

图4 虫草素介导的肠道代谢物水平调节因应激而受损。(A) 热图显示四组之间代谢物的差异；(B) 四组代谢物的Venn图；(C) 应激+ 12.5 mg/kg虫草素组和应激+水组之间显著差异代谢物富集的 KEGG通路；(D) 应激+ 25 mg/kg 虫草素组和应激+水组之间显著差异代谢物富集的 KEGG通路。

4. 不同剂量虫草素逆转了由压力应激诱导的小鼠血清中多种炎症细胞因子水平的升高

外周细胞因子水平的改变与精神疾病抗抑郁治疗效果有关，因此我们检测了虫草素治疗的应激小鼠血清中多种细胞因子的水平。与对照组相比，应激+水组血清中IFN-γ(t(2,12)=2.722, P = 0.0185，图5A)和IL-10 (t(2,12)=2.359, P = 0.0361，图5D)水平显著升高。而与应激+水组相比, 应激+12.5 mg/kg虫草素组中IFN-γ(F (17) = 7.701, P = 0.0434,图5A)和IL - 1β(F (17) = 14.38, P = 0.0064,图5B)在血清中的含量显著减少，在应激+25mg/kg虫草素组血清中，IFN-γ(F (17) = 7.701, P = 0.0037,图5A)、IL - 1β(F (17) = 14.38, P = 0.0002,图5B)、IL - 6 (F (17) = 5.537, P = 0.0145,图5C)、IL - 10 (F (17) = 6.544, P = 0.0061,图5D)和TNF-α（F (17) = 4.736, P = 0.0189,图5F）均显著降低。三组小鼠血清中IL-17A含量无显著差异（F(2,17) = 3.124, P = 0.0699，图5E）。因此25 mg/kg 虫草素可显著降低应激诱导的血清中IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平升高。

图5 虫草素对小鼠血清细胞因子变化的影响。(A）血清中IFN-γ的表达；（B）血清中IL-1 β的表达；（C）血清中IL-6的表达；（D）血清中IL-10的表达；（E）血清中IL-17A 的表达；（F）血清中TNF-α的表达。

5. 虫草素对微生物-肠-脑-脂肪轴的关键作用因子的相关性网络分析提示虫草素对机体稳态的神经-代谢调控的整合效应

为了分析小鼠行为、神经递质、细胞因子、代谢物和肠道微生物之间的关系，我们对应激+水组和应激+12.5mg/kg虫草素组进行了相关性分析。结果显示，与应激+水相比，12.5 mg/kg虫草素灌胃显著增加了应激诱导的OFT中间区停留时间（图1A）、EPM中开放臂停留时间（图1B）和TST中静止时间（图1E）。同时显著降低血清（图1H）和前额叶皮层（PFC）（图1I）中5-HIAA含量以及血清中IFN-γ（图5A）和IL-1β含量（图5B），显著改变了NK4A214_group的丰度（图3F）和肉豆蔻酸（Myristic acid）、PC（15:0/18:1(11Z)）、反油酸（Elaidic acid）等的含量（图4A）。对应激+水组与应激+12.5mg/kg虫草素组在行为、神经递质、细胞因子、代谢物、肠道微生物等指标上有显著差异的指标进行相关性分析。结果显示肉豆蔻酸和PC（15:0/18:1(11Z)）可能受到NK4A214_group丰度变化的影响。肉豆蔻酸和PC（15:0/18:1(11Z)）水平与IFN-γ和IL-1β水平呈正相关。血清和PFC中5-HIAA水平与IFN-γ、IL-1β水平呈正相关。中间区停留时间（OFT）和开放臂停留时间（EPM）与血清和PFC中5-HIAA含量呈显著负相关，静止时间（TST）与血清和PFC中5-HIAA含量呈显著正相关（图6A）。

为了分析小鼠细胞因子、代谢物、肠道菌群和脂肪之间的关系，我们对应激+水组和应激+25mg/kg虫草素组进行了相关性分析。前面的结果显示，与应激+水组相比，应激+25mg/kg虫草素组血清IL-6（图5C）、IL-10（图5D）和TNF-α（图5F）含量显著降低。Prevoteaceae_UCG-001和脱硫弧菌的丰度（图3E, 3G）和腺苷-5'-单磷酸、L-丙氨酸、鹿花菌素等的含量显著改变（图4A）。在外周，25mg/kg虫草素显著改善了应激诱导的pWAT和sWAT重量的降低（图2A）。相关性分析结果显示Prevoteacea_UCG-001的丰度与L-丙氨酸含量呈显著负相关，与腺苷-5'-单磷酸含量呈显著正相关。脱硫弧菌丰度与腺苷-5'-单磷酸含量呈显著负相关，与L-丙氨酸含量呈显著正相关。腺苷-5'-单磷酸含量与IL-6、IL-10、TNF-α含量呈正相关。L-丙氨酸含量与IL-6、IL-10、TNF-α含量呈负相关。Prevoteacea_UCG-001丰度与pWAT和sWAT重量呈显著负相关。脱硫弧菌丰度与pWAT和sWAT重量呈显著正相关（图6B）。

图6 虫草素对行为、神经递质水平、细胞因子水平、代谢物水平、微生物组组成和脂肪组织含量的相关性分析。(A) 应激+水与应激+12.5mg/kg虫草素间比较，行为、神经递质水平、细胞因子水平、代谢物水平、微生物组组成和脂肪组织含量之间的关系图；(B) 应激+水和应激+25mg/kg虫草素细胞因子水平、代谢物水平、微生物组组成和脂肪组织含量之间的关系图。红线表示显著正相关，蓝线表示显著负相关。

在本研究中，应激诱导的焦虑/抑郁小鼠的内脏脂肪和皮下脂肪重量明显下降；与之前的报道一致，这种下降与应激导致的糖皮质激素水平升高有关。在应激诱导抑郁的小鼠中，交感神经活性上调，会增加脂肪代谢，减少脂肪和体重。本研究中25 mg/kg虫草素能显著降低糖皮质激素水平和交感神经活性，从而将应激减少的脂肪提高到相对正常的水平，表明虫草素对高糖皮质激素水平引起的代谢紊乱具有保护作用。本研究中使用的低剂量（12.5 mg/kg）虫草素能降低应激引起的糖皮质激素水平的升高，改善神经系统的活动，改善抑郁小鼠的行为异常。高剂量（25 mg/kg）虫草素可进一步降低糖皮质激素水平，并改善肠道微生物群水平，从而改善新陈代谢。总之，我们发现虫草素可改善体内脂肪含量，恢复因压力引起的焦虑/抑郁而减少的体内脂肪含量。

神经免疫在焦虑症的发病过程中起着至关重要的作用。焦虑症患者白细胞介素 IL-6、TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子水平升高，促炎因子和抗炎因子的失衡可能是焦虑症病理生理学的关键。在本研究中25 mg/kg 虫草素可显著降低应激诱导的血清 IFN-γ、IL-1 β、IL-6、TNF-α和 IL-10水平的升高，这与之前观察到的虫草素可影响脂质代谢以及血清中细胞因子水平的观点一致。文献报道慢性应激会上调大脑中5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）。在本研究中，我们发现虫草素降低了血清和前脑功能区中5-HIAA的含量，这进一步证明了虫草素在治疗焦虑/抑郁方面的疗效。

我们的研究表明，通过胃肠道给药的虫草素除了对中枢神经系统具有抗焦虑/抗抑郁作用外，还对外周的脂肪代谢具有保护作用，下一步我们希望探索新的虫草素给药模式，例如气溶胶吸入，以实现其快速的中枢作用而非外周作用。根据文献报道，脂肪代谢与抑郁之间存在直接的分子机制，如脂肪量和肥胖相关基因（FTO），因此探讨虫草素抗焦虑与改善脂肪代谢作用之间的平衡，可以更好地根据临床焦虑患者的实际情况，制定更加合理有效的个性化用药方案。此外，我们的数据还表明，虫草素的最佳处方剂量应根据患者合并精神疾病和代谢紊乱的程度来决定。这一观点进一步证实药物-宿主-微生物组之间的相互作用可能是导致剂量依赖性药物效应的原因。另外，还可以进一步探讨虫草素如何影响肠道微生物群，以及虫草素对肠道微生物群的影响与其对神经系统功能和脂肪代谢的影响之间的因果关系，以提供新的有效治疗方法，如将虫草素与肠道微生物群药物或其他相对应的治疗药物相结合，在改善神经系统疾病、代谢调节和脂肪代谢方面可能会有更好的有效前景。虫草素广泛的抗激酶作用是否也在这些保护过程中发挥了一定的作用也是一个值得探讨的问题。本研究为中药最佳剂量选择的系统性观点的重要性提供了新证据，从而实现最佳疗效和最小副作用。

结论

本研究首次证明虫草素通过对肠-脑-脂肪-轴的相关作用，减弱应激诱导的焦虑和抑郁样行为，并减少小鼠脂肪组织含量。我们发现12.5 mg/kg虫草素可显著减轻应激引起的焦虑和抑郁样行为；25 mg/kg虫草素可恢复因应激而减少的内脏和皮下脂肪组织含量。相关网络分析显示，12.5 mg/kg 虫草素处理逆转应激诱导的NK4A214_group肠道菌群变化，降低血清肉豆蔻酸和PC（15:0/18:1(11Z))水平。同时，前额皮质和血清5-羟基吲哚乙酸水平下调。25mg/kg虫草素可逆转应激诱导的肠道微生物群Prevoteaceae_UCG-001和脱硫弧菌丰度变化，升高血清L－丙氨酸水平，降低血清腺苷-5'-单磷酸水平。因此，虫草素改善了应激小鼠的焦虑和抑郁样行为以及脂肪代谢紊乱。我们的工作揭示了虫草素在应激引起的精神代谢紊乱中的剂量相关作用，这可能对中药的精确治疗具有重要意义。

https://doi.org/10.1016/j.biopha.2023.115796

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