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Introduction

据古书记载，中国大鲵(学名:Andrias davidianus)是中国传统的药物,具有抗衰老和治疗认知障碍的疗效。中国大鲵的肌肉富含人体必需氨基酸，特别是赖氨酸和色氨酸，是一种极具营养价值的传统食品。虽然野生中国大鲵已于1988年被列为二级濒危保护动物，但是，随着养殖技术的进步，我国已成功地发展了中国大鲵养殖业，并实现了中国大鲵养殖子二代的合理利用。

至今，对中国大鲵的营养成分的研究多聚焦于皮肤、黏膜和软骨等容易被酶催化水解的组织。虽然古文献记载中国大鲵肉对健康有益，但是，中国大鲵的肌肉难以被酶水解，从而限制了对中国大鲵肉的营养价值的研究和探索。

近年，有多个课题组提出了基于多组学分析肉类蛋白质组分，从而评估其营养价值的技术。但是，中国大鲵的基因组巨大(约为50 Gb)，以现有的技术重组中国大鲵的基因组极具挑战性，从而限制了中国大鲵基因组测序的进展。

为了突破这个瓶颈，并实现中国大鲵肉的生物活性成分的深度发掘，清华大学邢新会课题组开发了基于单分子实时(SMRT)测序技术分析动物肌肉组织中的生物功能性多肽的技术，成功地发掘出了中国大鲵肌肉中的多种生物功能性多肽。同时，本团队也通过酶催化反应降解中国大鲵肌肉，释放出了蛋白质中的二肽基肽酶IV (DPP-IV)的抑制肽VPI，证实了基于转录组分析所取得的结果与实验结果相符，并证明了该方法的有效性。此外，基于转录组分析所取得的数据可用作质谱分析的参考数据集，并用于指导中国大鲵蛋白质序列的生物功能性多肽的发掘 (正在进行实验验证，并已取得初步成果)。

Results and discussion

中国大鲵肉的转录组和蛋白组解析

SMRT测序结果揭示了中国大鲵的肌肉中含有11 688 个转录本，其平均长度为2 999.8 bp（最大和最小转录本长度分别为8 888和63 bp）；平均GC含量为47.1%（含量的最大值和最小值分别为23%和63.2%）(图1 a和b)。对转录本进行分析可以获得平均长度为1 507.8 bp 的10 703个编码区 (CDS)，（最大和最小长度分别为6 759和147 bp）；平均GC含量为50.1%(图1 a和b)。通过观察CDS长度的分布可以判断测序结果的可靠性。

图1 转录本的统计分析

以Nr、KOGs、Swiss-Prot、KEGG和Pfam数据库对转录本进行功能注释分析发现，有10 103(86.4%)、8 364(71.6%)、9 519(81.4%)、6 788(58.1%)和8 995 个(77.0%)个转录本可以被各数据库注释。其中，有10 157 个(86.9%)转录本可以在至少一个数据库中被识别，6 323 个(54.1%)转录本可以在所有数据库中被识别(图2)。同时，BLAST hits分析结果显示中国大鲵的蛋白质与两栖类生物Xenopus tropicalis和Picta bellii的蛋白质相似(图1 c)，进一步说明了测序结果的可靠性。

图2 转录本注释的统计分析

中国大鲵肉氨基酸组成分析

基于转录组计算和氨基酸成分分析实验对中国大鲵肉中的氨基酸组成进行分析发现CDS分析结果与实验结果吻合（图3 a）。两组实验中所取得的数据中，G、K、I、H、M的组成相似，而Q、N、W可能是酸处理后氨基酸降解转化的结果，无法在实验中测得（图3）。以上结果说明CDS分析结果是精确而可靠的。同时，CDS分析可以有效地观测到实验中受实验方法影响而降解的氨基酸存在，是优于氨基酸成分分析实验的方法。

图3 CGS肉中氨基酸成分分析

KEGG和GO功能解析

KEGG代谢通路注释结果如图4a所示，中国大鲵肉中大部分蛋白与信号转导、细胞群落和内分泌系统相关。负责信号转导的蛋白质属于环境信息处理的范畴。这个结果说明了CGS具有较强的环境适应性，与实际相符 (中国大鲵已经存在了1.65亿年)。此外，该结果还表明CGS血液具有较高的抗菌活性。丰富的内部调节系统也是中国大鲵长寿、免疫和抗氧化因子的来源。此外，KEGG代谢通路注释也发现了抗衰老相关蛋白质。这些蛋白质与中国大鲵的长寿 (至少60年) 相关（图4 a）。为了进一步确定在中国大鲵肉中表达的独特基因的功能分布，研究人员还进行了GO分析。其结果显示总共有3270个转录本在生物过程、细胞成分和分子功能的三个水平上被注释到45个GO分类中(图4b)。最多的注释转录本涉及生物过程;在这些转录本中，“细胞过程”(20.5%)、“代谢过程”(17.0%)、“单生物过程”(15.2%)、“生物调节”(13.2%)和“定位”(10.2%)所占比例最高。在细胞成分中，转录本主要富集于“细胞部分”(24.6%)、“细胞器部分”(22.7%)和“大分子复合物”(16.8%)。在分子功能方面，“结合”(49.8%)和“催化活性”(32.8%)构成了大部分转录本。此外，转录本中还能够观察到与连锁和催化相关的生物聚合物和序列，这表明中国大鲵肉可能具有抗氧化、长寿和抗肿瘤的功能。

图4 CGS肉类转录本的KEGG和GO注释分析

中国大鲵肉中长寿基因与功能多肽挖掘分析

CGS肉中转录组的功能分析筛选出16 个与寿命相关的基因。基于该结果，研究人员推测这些基因是中国大鲵长寿的关键。同时也证明了基于转录本解释功能基因的方法是可行的。此外，研究人员还进一步挖掘CGS肉中的功能多肽。通过使用6 种功能多肽数据库总共8 142 个功能多肽对CGS肉转录组进行筛选，发现CDSs序列中含有1 712 个功能多肽。其中抗菌肽的检出率最低(0.3%)，抗糖尿病肽(74.2%)、抗高血压肽(58.5%)、抗氧化肽(55.8%)、抗血栓肽(40.6%)是检出率最高的4种。这4 种功能肽对人体健康具有重要意义，说明中国大鲵肉是有效的保健食品，可用于食疗。为了进一步验证计算分析的结果，选择抗糖尿病肽VPI三肽作为模型，设计相应的酶从中国大鲵肉蛋白质中酶解出170.66 nmol/L 的VPI，与计算结果相符。综合以上结果，研究人员发现了中国大鲵肉中含有多种功能肽，可开发成功能性食品。

Conclusion

综上所述，通过SMRT测序对中国大鲵肉的转录本和CDS进行了解析。通过注释分析，挖掘出16个与长寿相关的基因；通过对肉蛋白的酶解生成DPP-IV抑制肽，证实了中国大鲵肉中的生物功能肽具有作为功能性食品的潜能。这项工作有助于加速中国大鲵肉和其他动物组织，特别是肌肉组织中的功能肽挖掘。

作者简介

共同第一作者、通信作者

关长阁，男，清华大学博士。主要研究方向为结合生物信息学、人工智能方法和生物实验挖掘传统食品资源中的功能性多肽与机制解析，目前对大鲵肉中功能多肽进行挖掘与机理解析、基于深度学习方法挖掘和预测功能多肽等方向进行了系统和深入的研究，在 Nature Communication、 Nucleic Acid Research、 Science China Life Science、 Metabolic Engineering、 Biotechnology Journal和Food Science and Human Wellness等期刊发表论文十余篇。

共同第一作者

陈政霖，日本东京工业大学博士 (学术)，目前担任日本产业技术综合研究所特别研究员。主要研究方向为 (1) 肠道免疫和靶向肠道免疫系统的经口药物递送系统的研究、(2) 应用物理学 (MEMS、光学)。目前对医用蛋白质、人类认知、应用物理学、生化分析进行深入研究。已在International Journal of Pharmaceutics、Journal of Bioscience and Bioengineering、Biotechnology and Bioengineering和Microbial Cell Factories等期刊发表数篇论文。

通信作者

邢新会，工学博士，日本东京工业大学院化学工程专业工学博士。清华大学化工系教授，生物医药与健康工程研究院主持工作副院长、博士生导师。主要研究领域：生物化工，生物育种及高通量微流控细胞培养/筛选技术与装备、酶工程、多糖多肽创制。团队坚持以问题为导向的工程科学思路，形成了基础和应用研究、技术和装备并重的学术特色，通过基础研究支撑应用转化，成功实现了多项科研成果的产业化应用。已在国内外学术刊物发表论文300余篇，H因子48（WoS），合作著书8本，译著教材2部，英文专著1部，获得发明专利80余件，其中3件国际专利，10余件专利转化应用。2002年至今担任清华大学化工系生物化工研究所所长，2009年至2018年6月担任清华大学化工系副主任。2019年6月至今，担任清华大学深圳国际研究生院生物医药与健康工程国际研究院教授。任第十、十一、十二届全国政协委员，中国侨联委员，北京市侨联副主席，清华大学侨联主席，北京市侨联特聘专家。担任《Journal of Future Foods》科学主编，《Biochemical Engineering Journal》副主编，《生物技术产业》（现更名为《合成生物学》）、《中国酿造》、《食品科学》、《生物工程学报》、《Food Sciences and Human Wellness》、《Enzymatic and Microbial Technology》、《Journal of Biotechnology》、《Industrial Biotechnology》编委。

Transcriptomic analysis of Andrias davidianus meat and experimental validation for exploring its bioactive components as functional foods

Changge Guana,1,*, Zhenglin Tanb,c,1, Shucheng Lia,b,1, Yi Wanga, Naoyuki Yamamotob, Chong Zhanga,d, Songjun Wange, Junjie Chenf, Xinhui Xinga,d,g,h,*

a Key Laboratory for Industrial Biocatalysis, Ministry of Education of China, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China

b School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, Yokohama 226-0026, Japan

c Sensing System Research Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba 305-8565, Japan

d Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

e Henan Giant Salamander Protection and Development Association, Luoyang 471000, China

f Intelligent Computing Research Center, Harbin Institute of Technology, Shenzhen 518071, China

g Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School, Shenzhen 518055, China

h Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen 518067, China

1These authors contributed equally to this work.

*Corresponding author.

Abstract

Andrias davidianus (Chinese giant salamander, CGS) is the largest and oldest extant amphibian species in the world and is a source of prospective functional food in China. However, the progress of functional peptides mining was slow due to lack of reference genome and protein sequence data. In this study, we illustrated full-length transcriptome sequencing to interpret the proteome of CGS meat and obtain 10703 coding DNA sequences. By functional annotation and amino acid composition analysis, we have discovered various genes related to signal transduction, and 16 genes related to longevity. We have also found vast variety of functional peptides through protein coding sequence (CDS) analysis by comparing the data obtained with the functional peptide database. Val-Pro-Ile predicted by the CDS analysis was released from the CGS meat through enzymatic hydrolysis, suggesting that our approach is reliable. This study suggested that transcriptomic analysis can be used as a reference to guide polypeptide mining in CGS meat, thereby providing a powerful mining strategy for the bioresources with unknown genomic and proteomic sequences.

Reference:

GUAN C G, TAN Z L, LI S C, et al. Transcriptomic analysis of Andrias davidianus meat and experimental validation for exploring its bioactive components as functional foods[ J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(1): 166-172. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250014.

文章编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意