这项研究首次表明天然抗菌剂 (AuraAqua)， 能够减少EHP疾病对虾的破坏性影响。

一、EHP的危害

微孢子虫病是由虾体内的细胞内肠细胞虫(EHP) 引起的，在养殖场之间，甚至有时在国家之间具有高度传染性。对EHP感染进行定期管理和监测，不仅是为了有效控制和预防该病，还可以防止感染引起对虾肠道菌群的变化，造成严重的后果，更严重的是对营养代谢和免疫力造成影响。

天然抗菌剂的混合物，例如：AuraAqua (Aq)，此前已被证明可以减少氧化应激，增强感染Nematopsis Messor的虾上皮细胞的免疫反应。此外，Aq还可以通过刺激宿主益生菌（如：Faecalibacter. prausnitzii）的生长和发育，来改善感染副溶血弧菌（SGP）的虾肠道中原代细胞的肠道健康。

二、研究方法

1、AuraAqua天然抗菌混合物，含有5%麦芽糖糊精、1%氯化钠、42%柠檬酸、18%柠檬酸钠、10%二氧化硅、12%苹果酸、9%柑橘提取物和3%橄榄提取物。

2、原材料由Bio-Science Nutrition Ireland提供，实验分为三份进行，最有效的浓度是通过计算逃逸的EHP孢子的百分比来确定的。

3、将孢子悬浮于50μL 0.1%、0.5%、1%和2% AuraAqua中，孵育24-48小时，然后用蒸馏水洗涤，然后，在显微镜下检查孢子挤出。

4、EHP和AuraAqua对虾SGP存活的体外影响

进行了两种实验方法：（I）将原代肠上皮细胞（SGP）暴露于0.1％；EHP孢子感染前0.5%、1% 和 2% Aq，以及 (II) 感染后，包括0.1%、0.5%、1% 和 2% Aq，并再培养24小时，测定法测量SGP细胞存活率。

暴露于EHP后，使用方法 (I) 或 (II)，将板在相同条件下（37°C，5% CO2）孵育，最后在测量前用100μL新鲜培养基清洗。通过向每个孔中添加10μL MTT试剂(0.5 mg MTT/mL) ，并再孵育3小时来评估细胞存活率。

5、EHP感染后虾苗的计数

还通过攻击试验检查了Aq对EHP感染的影响。将120尾健康白对虾苗置于无菌培养皿中，并暴露于2×106孢子/孔中24小时。感染时使用浓度为0.5%的抗菌混合物水溶液，并在感染后24小时后测定存活率。

三、研究成果

1、感染EHP孢子的SGP细胞的存活率

为了确定Aq对孢子活性的影响，将EHP孢子暴露于0.1%、0.5%、1% 和 2% Aq。暴露于EHP孢子24小时（图1A）或48小时（图1B）会显着降低所有浓度的孢子活性，但暴露于 0.5% Aq后更加明显。在这两种情况下，感染EHP孢子的SGP细胞的活力均显着增加；然而，当受感染的细胞预先暴露于Aq时，观察到更明显的效果（图1C）。这些结果表明，Aq可以降低EHP孢子活性，并增加EHP感染的SGP细胞的存活率。

图1：24 小时 (A) 和48小时 (B) 后，Aq对EHP孢子活性的抑制。

2、Aq对SGP细胞的氧化应激作用

研究表明，SGP细胞的EHP感染会激活宿主NADPH氧化酶，添加0.5% Aq可以逆转这种作用。此外，过氧化氢酶和超氧化物酶歧化酶激活的诱导不依赖于EHP孢子和SGP细胞之间的物理相互作用。这一结果促使进一步的实验旨在研究NF-κB信号通路在CAT和SOD产生控制中的作用。

在EHP感染的SGP细胞中观察到的NF-κB p65信号通路的激活，在0.5% Aq存在下显着降低，并且与p65 P-ser磷酸化的丧失相关。当虾感染EHP并破坏肌动蛋白细胞骨架的稳定性时，EHP会激活宿主NADPH氧化酶产生H2O2，H2O2负责通过p65的P-ser磷酸化氧化激活NF-κB通路。在0.5% Aq存在下，CAT和SOD酶产量的增加进一步增强了该效果。

3、Aq体内作用的测定

研究结果表明，0.5% Aq暴露24小时后，可将感染EHP的虾的死亡率降低至20%以下（图 2A）。在EHP感染组中，在0.5% Aq存在的情况下，过氧化氢酶活性呈增加趋势 ( p < 0.0001)（图2B）。在感染和治疗的肠道组织中，SOD也显着增加（p=0.001）（图2C）。

与感染对照相比，用0.5% Aq处理的EHP感染虾所有这些AMP的mRNA水平均显着降低（p < 0.05），但PEN4和溶菌酶除外，但未观察到显着降低。这些研究证实，Aq可以通过抑制NF通路激活引发的促炎事件，减少感染EHP虾的负面影响，并提高白对虾的存活率。

图2：0.5% Aq对白对虾抗氧化能力的影响。(A) 死亡率，(B) CAT活性，(C) SOD活性。

四、得出结论

研究表明，天然抗菌物质Aq的混合物可以阻止EHP孢子的成熟，减少对虾肠上皮细胞的感染（图3(1)）。在体外，Aq抑制肌动蛋白聚合（图3(2)）并减少能够感染SGP细胞的EHP孢子数量（图3(3)）。SGP细胞感染期间Aq的存在阻止了NADPH氧化酶的激活（图3(4)），增加了CAT和SOD表达（图3(5)），并减少了H2O2的产生和释放水平（图3(6)）。CAT和SOD产量的增加与NF-κB去磷酸化相关（图3(7)）。此外，NF-κB去磷酸化的缺失还会导致AMP产生减少（溶菌酶、Crustin1和2，以及PEN2、3和4）（图3(8)），体内显示死亡率显着下降，这些事件与体外观察有关，显示CAT和SOD产量增加（图3）。

图3. 使用虾肠道感染模型，Aq对体外和体内EHP感染的影响

总的来说，使用天然抗生素混合物可以提高病虾的营养利用率，增强对细菌性疾病的抵抗力，对存活率产生积极影响。这项研究首次表明天然抗菌药物有可能减少EHP对虾的破坏性影响。