肠道不仅具有消化吸收功能，还是机体最大的“天然免疫器官”。环磷酰胺是一种常用的化疗药物，广泛用于治疗血液恶性肿瘤和各种上皮肿瘤。然而大剂量的环磷酰胺会损伤胃肠黏膜，从而导致机体产生免疫缺陷，并增加继发性感染的风险。目前从大豆、三文鱼、小麦、乳清和胶原蛋白中发现了很多具有免疫调节活性的多肽。有研究发现，鳀鱼（Engraulis japonicus）蛋白水解物可显著减轻动脉粥样硬化及巨噬细胞RAW264.7的氧化应激，而鳀鱼蛋白肽在肠道免疫调节活性方面的研究还鲜有报道。

中国海洋大学食品科学与工程学院的刘银媛，汪寒梅，赵雪*等使用超高效液相色谱-高分辨多级质谱联用技术分析鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽组成差异，然后采用环磷酰胺诱导肠黏膜免疫抑制小鼠模型，以大豆蛋白肽为对照，分析比较鳀鱼蛋白肽与大豆蛋白肽对肠道黏膜免疫调节的活性，以期为开发以鳀鱼蛋白肽为主要功能成分的健康食品以及改善化疗药物所致的肠黏膜免疫损伤相关的特医食品提供理论依据。

01

蛋白肽多肽组成分析

在前期研究中，为了提高蛋白肽的得率，本课题组对鳀鱼蛋白和大豆蛋白的水解条件进行了探索，发现鳀鱼蛋白使用中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解的得率最高，而大豆蛋白肽使用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解的得率最高。因此，以提高蛋白肽得率为目标，筛选出降解鳀鱼蛋白和大豆蛋白的最佳条件，获得了两种不同的蛋白肽产品（文章未发表）。如图1和表2所示，鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的重均分子质量分别为264.150 Da和413.124 Da，鳀鱼蛋白肽的重均分子质量小于大豆蛋白肽。鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽均含有人体所需的8 种必需氨基酸（赖氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val））。鳀鱼蛋白肽中谷氨酸（16.95%）、丙氨酸（12.00%）、赖氨酸（9.82%）、色氨酸（6.56%）和谷氨酸（16.95%）相对含量较高，而大豆蛋白肽中亮氨酸（8.08%）、天冬氨酸（9.40%）、亮氨酸（8.08%）、精氨酸（7.17%）和苯丙氨酸（6.35%）相对含量较高。大豆蛋白肽中天冬氨酸、酪氨酸和精氨酸相对含量远高于鳀鱼蛋白肽，丙氨酸和色氨酸相对含量远低于鳀鱼蛋白肽。

采用超高效液相色谱-高分辨多级质谱对蛋白肽进行分析，利用Peaks Online 1.7软件分析蛋白肽产品中所有多肽的序列和相对含量。超高效液相色谱能够将6 000 条多肽进行分离，四极杆-轨道阱超高分辨质谱可检测总离子强度为4.79×103～2.67×108的所有多肽。根据多肽的二级质谱，本研究从鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽中分别解析出5 680 条和7 666 条多肽的准确序列。根据维恩分析，鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽中多肽组成的差异如图2和表3所示。分析发现鳀鱼蛋白肽总肽段为5 680 条，2～5肽占比为65.05%；大豆蛋白肽总肽段为7 666 条，2～5肽占比（50.69%）低于鳀鱼蛋白肽，10肽以上的多肽占比（9.76%）高于鳀鱼蛋白肽（4.30%）。两种蛋白肽产品中相同的肽段为1 325 条（占比为11.0%），其中97.9%为2～5肽。鳀鱼蛋白肽中有4 355 条多肽段是其独有的，大豆蛋白肽中有6 341 条多肽段是其独有的。

由表4可知，鳀鱼蛋白肽中相对含量较高的多为2～5肽，还有少量的10肽、11肽。而大豆蛋白肽中相对含量较高的多为10肽以上的多肽，与分子质量分析结果相印证。本研究结果说明鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽种类和相对含量有很大不同。

02

蛋白肽对小鼠体质量和免疫器官指数的影响

分别给予小鼠100、300 mg/kg mb和500 mg/kg mb的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽30 d后，发现300 mg/kg mb鳀鱼蛋白肽和500 mg/kg mb大豆蛋白肽组小鼠的活动量增多，鼠毛光泽较好；而100 mg/kg mb鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽组小鼠的生命力均较差。如图3所示，通过观察HE切片可以发现，300 mg/kg mb和500 mg/kg mb的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽对小肠黏膜结构的保护效果都较好，没有明显差异。100 mg/kg mb的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽组小鼠的肠黏膜损伤仍比较严重。因此后续实验中采用300 mg/kg mb剂量的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽，比较两种不同蛋白肽的肠黏膜免疫调节作用。

在注射环磷酰胺前，各组小鼠均反应灵敏、精神状态良好、鼠毛光亮。如图4所示，正常组小鼠体质量在实验期内缓慢上升，而注射环磷酰胺的模型组小鼠体质量明显低于正常组，同时观察到小鼠懒惰、反应迟钝、活动量减少、鼠毛无光泽。与正常组小鼠相比，模型组小鼠胸腺和脾脏指数均显著降低（P＜0.05），说明环磷酰胺对小鼠机体和免疫器官造成了损伤。补充300 mg/kg m b 鳀鱼蛋白肽/大豆蛋白肽30 d后，虽然小鼠的体质量与模型组相比没有明显差异，但是其活动量增加、鼠毛光泽较好。与模型组相比，大豆蛋白肽可显著提高小鼠的胸腺和脾脏指数（P＜0.05）；鳀鱼蛋白肽可显著提高小鼠的脾脏指数（P＜0.05），但对胸腺指数没有显著影响，说明灌胃鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽可以减轻环磷酰胺诱导的小鼠免疫器官损伤。

03

蛋白肽对小鼠小肠黏膜组织形态的影响

如图5所示，正常组小鼠小肠绒毛结构完整，排列整齐且连接紧密。而模型组小鼠小肠绒毛矮短、松散，间隙增大，有些绒毛甚至断裂、脱落；同时绒毛长度和绒毛长度/隐窝深度值显著降低（P＜0.05），而隐窝深度显著增加（P＜0.05），说明环磷酰胺对小鼠小肠黏膜结构损伤严重。与模型组相比，300 mg/kg mb鳀鱼蛋白肽组与大豆蛋白肽组小鼠的小肠绒毛结构有所改善，绒毛长度显著增加而且排列较整齐，绒毛长度/隐窝深度显著增加（P＜0.05），隐窝深度显著降低（P＜0.05），说明补充鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽可以改善环磷酰胺对小鼠小肠黏膜结构的损伤，维持小肠的正常组织结构和生理机能，且鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽对小肠黏膜结构的保护效果并没有显著差异。

04

蛋白肽对小鼠小肠黏膜相关免疫因子表达的影响

小肠免疫体统中，T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13水平对肠黏膜的免疫功能非常重要。如图6所示，与正常组相比，模型组小鼠小肠免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的表达水平显著下降（P＜0.05），而300 mg/kg m b 鳀鱼蛋白肽组和大豆蛋白肽组小鼠小肠免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的表达水平均显著高于模型组（P＜0.05），且与胸腺肽组接近。说明环磷酰胺能显著抑制T细胞产生相关免疫因子，而鳀鱼蛋白肽与大豆蛋白肽可以改善环磷酰胺对免疫因子分泌的抑制。比较发现，鳀鱼蛋白肽组TNF-α水平显著高于阳性对照胸腺肽组（P＜0.05），说明鳀鱼蛋白肽促进TNF-α因子表达的效果更好。

05

蛋白肽对小鼠小肠免疫球蛋白IgA和SIgA表达的影响

如图7所示，相比于正常组，模型组小鼠小肠黏膜中免疫球蛋白IgA和SIgA的表达水平显著下降（P＜0.05），而300 mg/kg m b 鳀鱼蛋白肽组和大豆蛋白肽组小鼠小肠黏膜中IgA和SIgA的表达水平均显著高于模型组（P＜0.05）。说明环磷酰胺会抑制小肠黏膜免疫球蛋白IgA和SIgA的产生，而鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽能够改善环磷酰胺对IgA和SIgA的抑制。通过比较发现，鳀鱼蛋白肽组SIgA的表达水平显著高于大豆蛋白肽组和胸腺肽组（P＜0.05），说明鳀鱼蛋白肽促进肠黏膜免疫球蛋白SIgA表达的效果优于大豆蛋白肽。

06

蛋白肽对TLRs/NF-kB信号通路相关基因表达的影响

如图8所示，与正常组相比，模型组小肠中TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κB的mRNA相对表达量显著降低（P＜0.05），而大豆蛋白肽组和鳀鱼蛋白肽组TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κB mRNA相对表达量显著高于模型组（P＜0.05），说明补充大豆蛋白肽和鳀鱼蛋白肽能够改善环磷酰胺对TLR和NF-κB基因表达的抑制。比较发现，大豆蛋白肽组和鳀鱼蛋白肽组小鼠的TLR-4 mRNA表达水平、鳀鱼蛋白肽组小鼠的TLR-6 mRNA表达水平显著高于正常组小鼠（P＜0.05），说明鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽对TLR基因表达有显著的促进作用，但是二者对TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κB基因表达的影响没有显著性差异。

07

大豆蛋白肽和鳀鱼蛋白肽分别属于植物蛋白和动物蛋白，为了揭示其多肽组成差异及与生物活性之间的关系，本研究采用超高效液相色谱-高分辨多级质谱联用技术，结合PEAKS Online云计算平台，分析了酶解工艺制备的大豆蛋白肽和鳀鱼蛋白肽中所有多肽的相对含量和序列。经比较发现，两种蛋白肽产品虽然分子质量接近，但是多肽组成有很大的差异。从鳀鱼蛋白肽中发现了5 680 条肽段，从大豆蛋白肽中发现了7 666 条肽段。大豆蛋白肽中2～5肽相对含量（50.69%）比鳀鱼蛋白肽（65.05%）低，而10肽以上的多肽含量（9.76%）高于鳀鱼蛋白肽（4.30%），说明大豆蛋白肽分子质量较大。大豆蛋白肽和鳀鱼蛋白肽中相同的肽段有1 325 条，鳀鱼蛋白肽中有4 355 条独有的多肽，而大豆蛋白肽中有6 341 条独有的多肽。比较相对含量最高的15 个多肽的序列和相对含量，发现鳀鱼蛋白肽中相对含量较高的多为2～5肽，而大豆蛋白肽中相对含量较高的多为10肽以上的多肽。说明鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽序列和组成比例也有很大的不同，本研究结果为鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽生物活性研究提供了依据，也为生产出高活性蛋白肽产品提供了可靠的质量分析技术。

免疫调节肽中最常见的氨基酸残基是疏水性氨基酸（包括Gly、Val、Leu、Pro和Phe）、Glu和Tyr。文献[27]结果表明，疏水性氨基酸与一个或多个Glu、Gln、Tyr、Trp、Cys、Asp和Asn的组合是免疫调节肽的优选序列。根据这一原理将本研究中鉴定出的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽进行比较，发现绝大多数均为免疫调节肽。这一结果表明，免疫调节肽在本研究获得的鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽中占主导地位。它们的存在解释了鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽对环磷酰胺诱导的肠黏膜免疫抑制小鼠的影响。

肠道是机体重要的防御屏障，肠黏膜是机体抵御病原微生物的第一道防线。环磷酰胺易损伤自我更新的细胞（例如肠黏膜上皮细胞），因此快速生长的肠绒毛最容易受到攻击和损伤。而补充鳀鱼蛋白肽与大豆蛋白肽（300 mg/kg mb）30 d均可以改善肠黏膜免疫抑制小鼠的脾脏指数、胸腺指数及环磷酰胺造成的肠黏膜结构损伤，使小肠绒毛排列更加整齐，与模型组相比绒毛长度显著增加，隐窝深度显著降低，说明鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽可以改善环磷酰胺造成的小肠机械屏障结构的损伤，维持小肠的正常组织结构和生理机能。

肠道黏膜免疫是肠道重要的防御屏障，免疫细胞（主要为T 细胞）分泌的细胞因子在维持肠黏膜系统的平衡中也起着重要作用。辅助性T 细胞1（T helper cell 1，Th1）产生的IFN-γ和TNF-α作为标志性的细胞因子，被认为是细胞介导炎症的关键。Th2细胞产生的IL-4和IL-13可保护宿主免受细胞外病原体的侵袭。Th1和Th2细胞互相协调，调节肠黏膜平衡，维持机体正常的黏膜免疫功能。补充鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽可以很好地改善环磷酰胺对Th1和Th2细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的抑制，其中鳀鱼蛋白肽组TNF-α的含量高于胸腺肽组，说明鳀鱼蛋白肽与大豆蛋白肽可以减轻环磷酰胺对Th1和Th2细胞免疫反应功能的抑制，促进肠黏膜中免疫因子的产生。

SIgA 由多聚免疫球蛋白受体（polymeric immunoglobulin receptor，pIgR）、J-链和α-链组成，其由肠道上皮细胞分泌，是肠黏膜行使免疫屏障功能的主要因素，其可在黏膜表面形成保护层，抵抗细菌、病毒和其他病原体的黏附，防止肠道感染的发生。免疫细胞产生的IgA是肠道中含量最高的免疫球蛋白，其在内皮细胞之间通过细胞转运转化成SIgA，也是肠道黏膜SIgA的主要组成成分。本研究结果表明，鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽改善了环磷酰胺对上皮细胞分泌免疫球蛋白IgA和SIgA的抑制，从而保护肠黏膜的获得性免疫功能。Li Qiqi等也发现鳕鱼蛋白肽能够改善环磷酰胺对免疫球蛋白的抑制。经比较发现，鳀鱼蛋白肽促进肠黏膜细胞分泌SIgA的效果要优于大豆蛋白肽，说明不同的蛋白肽产品对免疫球蛋白表达量的影响有所不同。

TLR作为机体先天免疫的“哨兵”，其对应的配体被识别时会触发促炎细胞因子、趋化因子和共刺激分子的转录激活，随后启动对宿主存活至关重要的防御机制。本研究结果显示，与模型组相比，鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽组中TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κB的基因表达量均显著上调，改善了环磷酰胺对TLRs/NF-κB信号通路的抑制作用，与免疫因子和免疫球蛋白IgA、SIgA表达量上调的结果相印证，说明鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽可以通过影响TLRs/NF-κB信号通路中相关因子的表达，促进小肠中免疫因子和免疫球蛋白的分泌，从而保护小肠的免疫功能。

本研究发现鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽都有一定的肠道黏膜免疫保护活性，说明鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽中都含有提高免疫力的多肽。但值得重视的是，两种蛋白肽在调节肠免疫方面的活性和机制没有明显差异，这可能是因为蛋白质酶解物中多肽种类高达5 000～7 000 种，结合每种免疫多肽活性和含量综合考虑，由多肽组成的混合物在保护肠黏膜结构和调节小鼠黏膜免疫活性方面并没有明显差异。本研究基于超高效液相色谱-高分辨多级质谱联用的肽组成分析技术，为蛋白肽中免疫多肽的进一步挖掘提供了有效的技术和方法，为发现更多不同的免疫活性肽提供了可能性，为生产出具有高免疫活性的蛋白肽产品提供指导。

目前大豆蛋白肽已经广泛应用于健康食品和保健食品中，而鳀鱼蛋白肽的研究和应用较少。比较发现，鳀鱼蛋白肽与大豆蛋白肽在调节肠免疫活性方面效果相似，说明鳀鱼蛋白肽在健康食品方面也具有很好的应用开发前景。

08

结论

本研究采用超高效液相色谱-高分辨多级质谱联用技术，结合PEAKS Online云计算平台，研究鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽中多肽的序列和比例。本研究发现补充300 mg/kg mb鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽30 d能够减少环磷酰胺造成的小鼠体质量下降，提高小鼠的胸腺指数和脾脏指数，保护肠黏膜组织结构，上调小肠免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-13和免疫球蛋白SIgA、IgA的表达，同时上调TLRs/NF-κB信号通路中TLR（TLR-4、TLR-6、TLR-9）和NF-κB基因的表达，说明鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽改善环磷酰胺引起肠黏膜损伤的作用机制与TLR介导的NF-κB信号通路相关。虽然鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽组成存在较大差异，但是活性实验结果表明，鳀鱼蛋白肽仅在促进肠黏膜SIgA表达方面优于大豆蛋白肽，鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽在改善环磷酰胺造成的肠黏膜损伤、免疫因子的表达、TLRs/NF-κB信号通路重要因子表达等方面并没有明显差异。

本文《鳀鱼蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽组成和小肠黏膜免疫调节活性比较》来源于《食品科学》2023年44卷第19期107-117页，作者：刘银媛，王寒梅，逯良忠，沈金华，杨 颖，赵 雪。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230103-015。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及百度百科。

非热加工专栏：江苏大学邹小波、石吉勇教授等：米糠非热稳定化处理技术研究进展