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Abstract

传统的转基因检测方法需要较高的测试条件，难以既灵敏又高效。本研究提出了针对CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac的一管式双重组酶聚合酶扩增( RPA )反应体系，并结合侧向流动免疫层析法，命名为" Dual-RPA-LFD "，用于转基因作物的可视化双重检测。其中，考虑到目前应用最广泛的抗虫和耐除草剂性状及其叠加性状的现状，选择耐除草剂基因CP4-EPSPS和抗虫基因Cry1Ab/Ac作为靶标。以梯度稀释的质粒、转基因标准品和实际样品为模板，分别进行灵敏度、特异性和实用性检测。所构建的方法实现了质粒在低至100 copies水平的可视化检测，证明了其高灵敏度。此外，对转基因样品具有良好的适用性，两测试系之间无交叉干扰，也不受其他基因的影响。总之，该策略实现了在37 °C、20 min内快速、无仪器的现场同时检测转基因作物中两种流行靶标的预期目的，为转基因检测的现场快速筛查提供了新的选择。

Introduction

近年来，转基因作物的大规模应用有利于环境友好型农产品的发展。然而，关于转基因作物的争议一直持续存在，相应的风险评估和安全检测工作十分必要和迫切。2019年，叠加的抗虫/耐除草剂( IR/HT )性状数量增长了6%，这些作物覆盖了全球转基因作物种植面积的45%，使叠加的IR/HT性状首次成为转基因作物的优势性状。因此，相关IR/HT基因已成为快速转基因检测的主流靶基因。CP4-EPSPS、pat和bar是耐除草剂作物中普遍存在的基因，大多数商业化抗草甘膦作物中都含有CP4 - EPSPS基因。此外，苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis，Bt )的Cry基因具有抗多种害虫(鳞翅目，鞘翅类和双翅目昆虫)，已被广泛应用于大多数抗虫转基因作物。

许多基于核酸或蛋白质的转基因检测方法已经建立并商业化应用于转基因作物的监测。基于DNA的聚合酶链式反应(PCR)和基于蛋白质的酶联免疫吸附试验(ELISA)常被视为检测转基因作物的传统方法。基于蛋白质的免疫学方法由于其简单、快速和易于操作而被广泛用于原位检测，但这些方法基于活性结构，因此容易受到干扰和样品变性的影响。PCR方法依赖于多种仪器设备，对操作人员的熟练程度和实验室条件要求较高。尽管这些方法(PCR和ELISA检测)在实际应用中具有出色的可靠性和稳定性，但随着转基因作物产量的不断增加和复杂的堆叠性状，需要更先进的技术才能在室外环境中实现高效的检测。

目前，许多新的核酸扩增技术在时间和设备上规避了传统PCR方法的局限性，为转基因作物检测提供了新的工具，如环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等。其中，RPA因其高效、反应温度易实现(37~42 ℃)等优点，已被广泛用于核酸检测。近年来，出现了RPA结合琼脂糖凝胶电泳(RPA-AGE)、实时荧光等策略RPA (RT-RPA) 、RPA联合DNA荧光染料(RPA-SYBR GreenⅠ)、RPA联合侧向流免疫层析( RPA-LFD )和RPA联合 Cas12a裂解系统(RPA-Cas12a-FS) 已经在快速检测领域建立并实现。在这些方法中，试纸条法因其完全独立于检测设备，最适合现场检测。

本研究通过对两对引物的正向和反向片段分别标记，构建了双重RPA体系，旨在实现利用单一免疫层析试纸条同时检测CP4-EPSPS和Bt-Cry1Ab/Ac基因。对于这种策略，在一个反应体系中两种不同标记物的扩增产物可以分别被试纸条上的相应抗体捕获，相应的抗体固定区域变红，可以通过肉眼判断。该方法无需借助PCR仪或电泳仪等设备，可在田间环境下进行，满足同时鉴定CP4-EPSPS和Bt-Cry1Ab/Ac基因的快速检测需求。此外，结果表明该方法具有良好的检测性能和稳定性。

Results and discussion

引物用量优化

当使用一对引物时，如图1A所示，随着引物浓度的变化，该试纸条的T1线与T2线的趋势一致。在较低的引物浓度(3 μmol/L)下，这些试纸条在阳性条件下不能形成清晰的T线。引物浓度为5 μmol/L时，阳性样品可见T线，阴阳性区分明显。此外，当引物浓度增加到7 μmol/L时，在阴性条件下开始观察到非特异性的微弱T线。因此，确定5 μmol/L的引物浓度为T1线和T2线可视化最合适的浓度。

在双RPA体系中，这些条带的着色条带及其对应的峰(图1B1)表明，随着Cry1Ab/Ac引物比例的增加，对应的T1检测线强度变强，而T2线相对变弱甚至不清晰。CP4-EPSPS引物用量的增加对应T2线的增强和T1线的减弱。试纸条上各检测线的变化趋势与电泳结果一致(图1B2)。从T线对应的峰面积直方图(图1B3 )可以看出，当两对引物以5 ：5的比例存在于RPA体系中时，T1线和T2线的强度相当，肉眼观察令人满意。在这种情况下，体系中各引物的终浓度为240 nmol/L。因此，在后续实验中，双RPA体系中所有引物的终浓度均为240 nmol/L。

图1 引物浓度优化

双RPA-LFD的特异性

特异性评估是该方法实际应用的重要组成部分。如图2所示，使用包含所有检测目标的质粒的阳性对照为3条红线，C线、T1线和T2线，表明Cry1Ab/Ac和CP4-EPSPS双阳性。不含这2 个目的基因的MS1和RF1与不含模板的空白对照一致，仅显示C系。NK603、RRS、甜菜H7-1、MON88913和MON89788与CP4 - EPSPS仅显示两条红线( C线和T2线)。Bt11、KF6、KMD1、MON531和MON87701含有Cry1Ab/Ac而不是CP4-EPSPS显示两条红线( C线和T1线)。结果与现行颁布的标准一致，从而验证了该方法的特异性(表S2)。

同时，图2所示的特异性结果表明，双重RPA - LFD检测方法能够特异性区分含有Cry1Ab、Ac和CP4-EPSPS的不同转基因作物，且T1株系和T2株系之间不存在相互干扰。

图2 双RPA-LFD的特异性

分子敏感性

对于灵敏性检测，如图3A所示，随着质粒浓度的降低，T1线和T2线的颜色整体呈减弱趋势。对于高质粒浓度(100~106 copies/μL)，试纸条呈现3条红线，Cry1Ab、Ac对应的T1线和CP4-EPSPS对应的T2线清晰可见。相比之下，低浓度(1~10 copies/μL)或不加模板的空白对照(N)对应的试纸条在C线处只有一条清晰的条带。该策略对Cry1Ab/Ac和CP4-EPSPS的可视化检测限均为100 copies/μL。图3B中测试谱线的对应峰型证实了视觉评估的趋势。结果表明，10 copies/μL和1 copy/μL的检测结果与空白对照(N)无显著性差异(P > 0.05)，而100 copies/μL质粒的T1线和T2线的峰面积与空白对照有极显著性差异(图3C)(T1时P < 0.0001 , T2时P < 0.01)。

图3 双RPA-LFD的分子灵敏度

复杂样本检测

检测目标的基因组成可如表S2中进行分析。用于放大检测信号的RPA反应成功进行，如图4a所示。在图4b中，当加入了含有Cry1Ab/Ac和CP4-EPSPS的两个转基因样品后，试验条显示了与阳性对照相同的3条红线。此外，当添加两个只包含Cry1Ab/Ac的样品时，只显示C和T1可见，而当模板包含两个只包含CP4-EPSPS的样品时，只显示C和T2可见。所有的阴性/阳性结果都包含了使用现行发布的标准进行测试的成分，这表明该方法适用于市场环境中可能发生的复杂样品。

图4 双RPA-LFD复杂样本分析

实际样品的应用

利用基于Cry1Ab/Ac和CP4-EPSPS蛋白的免疫快速检测卡对5 个实际样品进行检测，结果均为阴性(图S1B)。使用双LFD-RPA策略对相同的样品进行检测，所有实际样品在所使用的试纸条上仅显示一条C线，即均为阴性(图S1A)。阳性对照出现相应条带，表明试验结果有效。结果表明，该方法非常适合于常规转基因作物中CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac的实验室和田间检测。

Conclusion

综上所述，本研究以Cry1Ab/Ac和CP4-EPSPS为靶标，成功构建了可用于转基因作物检测的双RPA体系RPA-LFD。该策略实现了两个100 copies目标物的同时可视化检测，具有良好的特异性、灵敏性和对复杂转基因作物样品的适用性。在后续的研究中，可以通过在检测系统中加入额外的转基因筛选元素或通过开发可容纳多个试纸条的特殊槽来实现田间检测中特定转基因活动的识别。

A dual-RPA based lateral flow strip for sensitive, on-site detection ofCP4-EPSPSandCry1Ab/Acgenes in genetically modified crops

Jinbin Wanga,b,1, Yu Wanga,c,1, Xiuwen Hua, Yifan Chena,b, Wei Jianga,b, Xiaofeng Liuc, Juan Liud,e, Lemei Zhud,e, Haijuan Zenga,b,*, Hua Liua,b,*

a Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding, Institute of Biotechnology Research, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China

b Crops Ecological Environment Security Inspection and Supervision Center (Shanghai), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai 201106, China

c School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China

d School of Public Health, Changsha Medical University, Changsha 410219, China

e Academician Workstation, Changsha Medical University, Changsha 410219, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding authors.

Abstract

Traditional transgenic detection methods require high test conditions and struggle to be both sensitive and efficient.In this study, a one-tube dual recombinase polymerase amplification (RPA) reaction system for CP4-EPSPS and Cry1Ab/Ac was proposed and combined with a lateral flow immunochromatographic assay, named “Dual-RPA-LFD”, to visualize the dual detection of genetically modified (GM) crops.In which, the herbicide tolerance gene CP4-EPSPS and the insect resistance gene Cry1Ab/Ac were selected as targets taking into account the current status of the most widespread application of insect resistance and herbicide tolerance traits and their stacked traits.Gradient diluted plasmids, transgenic standards, and actual samples were used as templates to conduct sensitivity, specificity, and practicality assays, respectively.The constructed method achieved the visual detection of plasmid at levels as low as 100 copies, demonstrating its high sensitivity. In addition, good applicability to transgenic samples was observed, with no cross-interference between two test lines and no influence from other genes.In conclusion, this strategy achieved the expected purpose of simultaneous detection of the two popular targets in GM crops within 20 min at 37 ℃ in a rapid, equipmentfree field manner, providing a new alternative for rapid screening for transgenic assays in the field.

Reference:

WANG J B, WANG Y, HU X W, et al. A dual-RPA based lateral flow strip for sensitive, on-site detection of CP4-EPSPS and Cry1Ab/Ac genes in genetically modified crops[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(1): 183-190. DOI:10.26599/FSHW.2022.92500015.

翻译：丛美娟（实习）

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：原文

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