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Introduction
目前对于骨质疏松的治疗主要通过使用合成激素、抗吸收疗法等方法进行药物治疗，然而，这些药物大多数具有一些局限性和不良影响，会带来许多并发症，包括肾病、胃肠道不耐受、肌肉无力，甚至伴有病理性的骨坏死，限制患者的长期服药。
VD的食物来源有限，钙只能从食物中获取，饮食中钙摄入量的减少与骨量减少有关。牛奶是最常见的补充钙食物，但目前的研究都局限于添加不同益生菌的发酵乳品和强化添加VD、钙的奶粉及保质期较长的常温牛奶对骨骼健康的影响，随着消费者健康意识的增强，在生活中更倾向选择新鲜、保质期较短的巴氏杀菌奶。但目前还没有关于鲜牛奶对骨质疏松症的研究。
肠道微生物区系作为人体内关键的微生态系统，与人类的健康息息相关。近年来，学者们发现肠道微生物通过调节激素分泌、影响免疫反应，促进与骨形成相关的营养物质的吸收和代谢，以及维持肠道屏障功能来调节骨量，参与绝经后骨质疏松症的发病机制。目前益生菌、益生元和粪菌移植在预防和治疗绝经后骨质疏松症方面取得了早期成功。但是没有钙强化鲜奶摄入对肠道菌群影响的相关研究，
因此，本文旨在探索强化添加乳钙、VD和CPP等营养素的鲜牛奶对去卵巢Sprague Dawley大鼠模型的骨骼干预效果，并探讨骨代谢调节的作用机制。
大连工业大学生物工程学院王起山（第一作者）、北京三元食品股份有限公司常务副总经理、国家母婴乳品健康工程技术研究中心主任、国家动物健康与食品安全创新联盟副理事长陈历俊博士（通信作者）等 在本文以卵巢切除大鼠为研究对象，补充高钙或对照鲜牛奶三个月后，通过16SrRNA基因测序发现了去卵巢大鼠肠道微生态与骨骼之间的相关性，为骨-肠轴的相互作用提供了新证据，并且高钙鲜牛奶可以显著提高去卵巢大鼠的腰椎和股骨骨密度，以及股骨骨矿含量和承压强度，改善股骨骨小梁结构。
Results and Discussion
高钙鲜牛奶对去卵巢大鼠骨微结构的影响
采用显微CT技术观察高钙鲜牛奶对去卵巢大鼠骨骼参数的影响。与sham组相比，切除卵巢两个月后的去卵巢大鼠股骨表现出明显的骨质疏松（图2B）。干预3个月后，空白模型组（卵巢切除术后5个月）大鼠与健康对照组（假手术后5个月）大鼠相比出现严重的骨小梁骨丢失。虽然对照牛奶对股骨的骨质疏松有一定缓解作用，但骨小梁仍有较大的空隙结构。相比之下，高钙牛奶组大鼠的骨小梁形态结构更为完整，接近健康对照组（图2C），此外，干预3个月后，股骨骨小梁参数表明，高钙鲜牛奶对骨骼的保护作用优于对照牛奶（图2D-I）。
高钙鲜牛奶对去卵巢大鼠骨矿含量、骨密度和骨强度的影响
高钙鲜牛奶显著提高了去卵巢大鼠股骨骨矿含量（P＝0.031）。与去卵巢组相比，高钙鲜牛奶和对照牛奶的补充都增加了腰椎和股骨的骨密度，但只有高钙牛奶组的去卵巢大鼠股骨提高具有显著性（P＝0.022；高钙牛奶组腰椎L5和L6的P值分别为0.082和0.068）。此外，高钙牛奶组大鼠股骨承压强度显著提高（P＝0.033）。（图3）
高钙鲜牛奶对去卵巢大鼠骨转换标志物的调节作用
图4为干预前后大鼠骨转换标志物的变化结果。干预3个月后，与空白模型组相比，高钙牛奶组和对照牛奶组雌激素（E2）水平有升高趋势，但不显著。同时，高钙鲜牛奶的补充使去卵巢大鼠的ALP水平降低到与健康对照组相似的水平。在骨形成标志物中，高钙牛奶组OC和PINP水平升高，但不显著，而OPG水平显著升高（P＝0.004），RANKL水平在四组间无显著差异。此外，高钙牛奶组去卵巢大鼠破骨细胞标志物CTX水平降低，TRACP-5b水平显著降低（P＝0.00005）。
高钙鲜牛奶对去卵巢大鼠肠道菌群的调节作用
干预3个月后，空白模型组的去卵巢大鼠肠道内酸杆菌门（Acidobacteriota）和放线菌门（Actinobacteriota）的相对丰度分别降低了15%和10%，而拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度分别增加了13%和14%。高钙牛奶组大鼠的酸杆菌门（Acidobacteriota）和放线菌门（Actinobacteriota）的丰度分别增加了10%和6%，而拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）的丰度分别降低了9%和11%，与健康对照组的菌门丰度相似。在对照牛奶组中，酸杆菌门（Acidobacteriota）的丰度增加了6%，而放线菌门（Actinobacteriota）的丰度减少了5%，并且拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）的丰度没有明显变化，说明对照牛奶对去卵巢大鼠肠道内菌门相对丰度的作用效果不如高钙鲜牛奶（图5A）。
sham组大鼠的肠道菌属主要包括Subgroup 2、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、SC-I-84、Ellin6067、Candidatus udaeobacter、Candidatus solibacter、苔藓杆菌属（Bryobacter）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）（总丰度：sham组67%，健康对照组60%）。当卵巢切除2个月后，这些菌属的总相对丰度降低5%，干预3个月后，空白模型组（卵巢切除5个月）这些菌属的总相对丰度降低55%，优势属转变为罗河杆菌属Rhodanobacter（28%）、Phos-He36（27%）、中华单胞菌属（Sinomonas）（18%）和硫单胞菌属（Thiomonas）（13%）。经过高钙鲜牛奶干预后，空白模型组的4个菌属的相对丰度分别降低了12%、21%、16%和10%，更接近健康对照组大鼠菌属相对丰度的比例（图5B）。
α-多样性指数分析显示（图5C-D），切除卵巢5个月后，空白模型组与shan组相比，反映样本中物种丰富度的Observed species指数以及反映物种的丰富度和均匀度的Shannon指数均显著下降。这表明卵巢切除后，去卵巢大鼠肠道微生态遭到严重破坏。干预3个月后的高钙牛奶组大鼠与空白模型组相比，肠道微生物Observed species指数以及Shannon指数均显著提高。
在大鼠肠道菌的差异性分析中，发现了在科水平上的八种组间显著差异菌，以及在京都基因与基因组百科全书（KEGG）的第三级功能中发现了六种相关显著差异功能通路，并揭示了它们和骨骼指标之间的相关性（图6）。
甲基寡源菌科（Methyloligellaceae）、莱朗杆菌科（Reyranellaceae）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）、东氏菌科（Dongiaceae）、双生球菌科（Geminicoccaceae）和豆形囊菌科（Phaselicystidaceae）与血清素突触信号通路、松弛素信号通路、类固醇激素生物合成信号通路、不饱和脂肪酸生物合成信号通路呈显著正相关，而与VB6代谢信号通路与抗叶酸途径信号通路呈显著负相关。脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）和棒状杆菌科（Corynebacteriaceae）与血清素突触信号通路、松弛素信号通路、类固醇激素生物合成和不饱和脂肪酸生物合成信号通路呈显著负相关，而与VB6代谢和抗叶酸途径信号通路呈显著正相关。血清素突触信号通路、松弛素信号通路、类固醇激素生物合成通路和不饱和脂肪酸生物合成通路与OC、股骨骨密度、腰椎（L5-L6）骨密度显著正相关显著正相关，与TRACP-5b显著负相关。VB6代谢及抗叶酸途径与股骨骨密度、腰椎骨密度 （L5-L6）呈显著负相关，与TRACP-5b呈显著正相关。总的来说，这些研究结果表明，这6 个功能基因通路可能通过调节代谢途径在维持正常骨密度中发挥重要作用，肠道微生物群可能通过调节宿主代谢来影响绝经后骨质疏松症的进展。
肠道菌群是骨量的关键调节因子，肠道菌群的组成和丰度与骨密度和骨转换标志物相关，而高钙鲜牛奶可选择性调节去卵巢大鼠肠道菌群，并通过几种特定的基因功能通路调节骨的合成代谢，有效促进骨骼健康（图7）。
Conclusion
高钙鲜牛奶增加去卵巢大鼠肠道菌群的丰富度和多样性，调节肠道菌群通过类固醇激素生物合成途径、松弛素信号通路、血清素突触通路和不饱和脂肪酸生物合成途径，作用于骨代谢，延缓雌激素损失，降低了骨吸收标记物水平，并通过增加骨形成标记物水平刺激成骨细胞活性。通过OPG/RANK/RANKL/信号通路抑制破骨细胞功能，减弱骨吸收，从而对去卵巢大鼠腰椎和股骨的骨矿含量、骨密度、骨微结构、骨小梁参数和骨抗压强度产生积极影响。结果表明，高钙鲜牛奶是改善原发性绝经后骨质疏松症的一种有效干预措施。
第一作者
王起山，生物与医药硕士在读。本科和硕士就读于大连工业大学，硕士在读期间在国家母婴乳品健康工程技术研究中心联合培养2 年，主要研究方向为乳制品对骨质疏松的作用，发明专利受理1 项，以第一作者身份发表SCI论文2 篇，EI论文1 篇，中文核心论文1 篇，授权国家发明专利1 件。
通信作者
陈历俊，动物食品科学博士，教授级高级工程师。现任北京三元食品首席科学家、副总经理。入选国家级“万人计划”、科技创新领军人才、百千万人才工程突出贡献青年专家及北京学者、科技北京百名领军人才等，享受国务院政府特殊津贴专家，被授予中国杰出质量人、中国杰出工程师奖、全国劳动模范、北京市劳动模范与首都劳动奖章等30余项荣誉称号。主持/参与863计划等国家级科研课题13 项、市部级科研课题76 项，核心成果获国家科技进步二等奖2项、北京市等省部级科技进步奖20 项、中国食品工业协会特等奖等21 项，授权中国发明专利、国际专利49 项，制修订国家标准62 项，发表论文237 篇，出版论著19 部。
Calcium-fortified fresh milk ameliorates postmenopausal osteoporosis via regulation of bone metabolism and gut microbiota in ovariectomized rats
Qishan Wanga,b,c, Bin Liub,c, Xianping Lib,c, Junying Zhaob,c, Zongshen Zhanga, Weicang Qiaob,c, Xinyue Weia,b,c, Lijun Chena,b,c,*
a School of Bioengineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
b National Engineering Research Center of Dairy Health for Maternal and Child, Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd., Beijing 100163, China
c Beijing Engineering Research Center of Dairy, Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd., Beijing 100163, China
*Corresponding author.
Abstract
The aging of the global population has made postmenopausal osteoporosis prevention essential; however, pharmacological treatments are limited. Herein, we evaluate the effect of calcium-fortified fresh milk (FM) in ameliorating postmenopausal osteoporosis in a rat model established using bilateral ovariectomy. After 3 months of FM (containing vitamin D, and casein phosphopeptides, 1000 mg Ca/100 g) or control milk (110 mg Ca/100 g milk) supplementation, bone changes were assessed using dual-energy X-ray absorptiometry, microcomputed tomography, and bone biomechanical testing. The results revealed that FM can regulate bone metabolism and gut microbiota composition, which act on bone metabolism through pathways associated with steroid hormone biosynthesis, relaxin signaling, serotonergic synapse, and unsaturated fatty acid biosynthesis. Furthermore, FM administration signif icantly increased bone mineral content and density in the lumbar spine and femur, as well as femoral compressive strength, while improving femoral trabecular bone parameters and microarchitecture. Mechanistically, we found that the effects may be due to increased levels of estrogen, bone formation marker osteocalcin, and procollagen type Ⅰ N-propeptide, and decreased expression of the bone resorption marker C-telopeptide and tartrate-resistant acid phosphatase 5b. Overall, the f indings suggest that FM is a potential alternative therapeutic option for ameliorating postmenopausal osteoporosis.
Reference:
WANG Q S, LIU B, LI X P, et al. Calcium-fortified fresh milk ameliorates postmenopausal osteoporosis via regulation of bone metabolism and gut microbiota in ovariectomized rats[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(3): 1258-1270. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250105.
文章编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅
封面图片来源：图虫创意
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