《食品科学》：中南林业科技大学蒋新元教授等：鞣花酸抑制酪氨酸酶的动力学、荧光光谱分析及分子对接

酪氨酸酶又称多酚氧化酶，是一种广泛分布于微生物、动物和植物中的含铜氧化酶。作为催化黑色素生成的关键限速酶，酪氨酸酶的异常表达会造成黑色素过度堆积，从而导致皮肤色素沉着障碍如雀斑、老年斑、黄褐斑甚至恶性黑色素瘤。此外，酪氨酸酶还参与水果和蔬菜的酶褐变，通常导致这些产品的色泽和感官特性改变，从而显著降低产品的质量和营养经济价值。鞣花酸（EA）作为一种天然多酚，具有抗癌、抗炎、抗氧化和美白等多重生理活性，目前广泛应用于食品、医药及化妆品领域。EA对酪氨酸酶具有强抑制作用，可以同时抑制酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶的活性。然而，目前鲜有对EA抑制酪氨酸酶及其机制的系统研究。在不同的酪氨酸酶来源中，双孢蘑菇酪氨酸酶与人类酪氨酸酶具有较高的相似性和同源性，是酪氨酸酶的主要廉价来源。

中南林业科技大学理学院的倪丹、蒋新元*、唐玉莲等以蘑菇酪氨酸酶为靶点，通过动力学分析、荧光光谱法探究EA对酪氨酸酶的抑制与互作机理，同时结合分子对接模拟进行验证补充，采用实验结合理论的方法，从分子水平综合分析EA对蘑菇酪氨酸酶的抑制机理，以期为EA在食品工业中作为保鲜剂的各种应用提供理论支撑。

1

EA对酪氨酸酶的抑制作用

图1可知，在相同溶剂下，EA和熊果苷在一定质量浓度范围内对酪氨酸酶有明显的抑制效果，且抑制率和质量浓度呈正相关关系。通过计算，EA的IC50为0.05 mg/mL，明显强于阳性对照熊果苷（IC50＝13.13 mg/mL），说明EA能够明显抑制酪氨酸酶活性。

2

EA对酪氨酸酶的抑制动力学

2.1 EA对酪氨酸酶抑制可逆性分析

由图2可知，4 条拟合曲线均交于原点，随着EA质量浓度的升高，曲线斜率越来越小，说明EA能够降低酪氨酸酶催化底物生成多巴色素的速率，但不能使酪氨酸酶完全失活，因此推测EA对酪氨酸酶是可逆抑制。

2.2EA对酪氨酸酶抑制类型分析

由图3和表2可知，通过Lineweaver-Burk双倒数曲线方程作图，得到了一组相交于第2象限的直线，随着EA质量浓度的增大，

V

K

K

K

K

K

3

EA对酪氨酸酶的荧光光谱猝灭分析

3.1EA对酪氨酸酶的荧光猝灭效应

由图4可知，酪氨酸酶溶液的最大荧光峰发射波长为347 nm，EA对酪氨酸酶的荧光具有特异性猝灭作用。在酪氨酸酶浓度一定的情况下，荧光强度随EA浓度增加呈现规律性降低，并且峰形不变，最大吸收峰没有明显的红移或蓝移。生理条件下（pH 7.4），当EA浓度为13.33 μmol/L时，其在25、31、37 ℃对酪氨酸酶的荧光猝灭率分别为62.18%、58.66%、58.13%，表明EA与酪氨酸酶荧光发色团结合，有效猝灭酶的内源荧光。

3.2EA对酪氨酸酶的荧光猝灭机制

为了确定猝灭机制，采用Stern-Volmer方程（式（5））计算荧光发射光谱数据：

式中：

K

Q

K

由图5A可知，在实验浓度范围内，Stern-Volmer图呈现良好的线性关系；随着温度升高，

K

K

3.3 EA对酪氨酸酶的结合常数与结合位点数

通过lg[

Q

F

F

F

K

n

K

K

n

3.4EA对酪氨酸酶结合的相互作用力

热力学参数可以根据公式（7）、（8）计算：

式中：Δ

G

K

H

T

S

由表3可知，∆

G

H

S

4

EA对酪氨酸酶的同步荧光光谱分析

如图6A所示，随着EA的加入，酪氨酸酶在Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm处荧光强度有规律地减弱，说明EA与酪氨酸酶中的两残基存在结合作用，导致两残基含量降低，与荧光猝灭结果对应。加入EA后，Tyr残基的最大荧光发射峰没有发生移动，而Trp残基的最大荧光发射峰由288.0 nm红移至290.0 nm，推测EA改变了Trp残基附近的微环境，使其暴露在亲水环境中，微环境极性增强，不利于酪氨酸酶催化反应优势构象的形成，从而使酪氨酸酶活性受到抑制。如图6B所示，在同样的EA浓度下，Trp的猝灭率普遍高于Typ，说明Trp残基对荧光猝灭过程中的贡献更大，EA的结合位点更靠近酪氨酸酶的Trp残基。

5

EA对酪氨酸酶的三维荧光光谱分析

由图7可知，加入EA后，酪氨酸酶荧光峰的强度由140.1下降至63.4，激发波长由280.0 nm红移至285.0 nm，这说明EA的加入改变了酪氨酸酶构象，复合物的形成使得荧光基团的微环境极性增大，疏水能力减弱，这与同步荧光光谱分析结果一致。

6

EA对酪氨酸酶相互作用的分子对接模拟分析

根据分析对接模拟结果，EA与酪氨酸酶的最佳构象ΔG为－7.2 kcal/mol（－30.1 kJ/mol），这与37 ℃（ΔG＝－27.08 kJ/mol）荧光结果相近，说明分子对接结果中EA在酪氨酸酶中结合位点可靠。 如图8A、B所示，EA分子镶嵌于酪氨酸酶的活性中心口袋的催化腔中，并且与周围的氨基酸形成相互作用。5 个氨基酸残基Tyr311、Gln307、Trp358、Lys376、Asp357组成的空腔紧密包裹EA小分子，与EA小分子产生疏水作用，减少了水的介入，有利于形成稳定的复合物。由图8C可知，氨基酸残基Glu356、Asp312、Thr308、Lys379分别与EA形成6 个氢键，键长分别为2.91、2.91、2.80、3.32、2.67、3.22 nm，短氢键的形成极大地促进EA与酪氨酸酶形成复合物，降低了酪氨酸酶的活性以及酶催化底物的能力。如图8D和表4所示，L-酪氨酸与酪氨酸酶对接结果中，位于b处的底物与EA在酪氨酸酶活性中心的位置高度重合；底物和EA竞争与酪氨酸酶的Tyr311、Trp358发生疏水相互作用力，同时，底物和EA竞争与酪氨酸酶的Asp312产生氢键，说明底物对酪氨酸酶产生竞争抑制特性。如图8E所示，EA能够与底物-酪氨酸酶结合形成三元复合物，说明底物对酪氨酸酶也具有非竞争抑制特性。综上，分子对接形象地表明EA对酪氨酸酶属于混合型抑制类型，既可以和游离酶结合，又可以与酶-底物复合物结合；EA主要通过疏水作用力和氢键与游离酶或酶-底物复合物进行结合，降低了酪氨酸酶铜离子协调酶活性的能力，导致酶活性受到抑制，分子对接验证并补充了上述光谱实验结果。

结 论

本实验探讨了EA对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用，并利用抑制动力学、荧光光谱分析结合分子对接模拟技术，系统研究了EA抑制蘑菇酪氨酸酶的分子机制。体外抑制结果显示，EA对酪氨酸酶有明显抑制效果，且存在剂量依赖性。抑制动力学结果显示，EA对酪氨酸酶的抑制作用表现为可逆的混合型抑制类型，EA与游离酶的结合比与酶-底物复合物的结合更紧密。荧光光谱猝灭分析表明，EA对酪氨酸酶存在静态猝灭作用，两者主要通过疏水作用力形成EA-酪氨酸酶复合物，只有1 个或1 类结合位点。同步和三维荧光光谱分析表明，EA使酪氨酸酶的微环境极性增大，疏水能力减弱，酪氨酸酶的疏水性氨基酸Trp残基更靠近结合位点。分子对接模拟分析补充验证了上述实验结果，形象地表明EA对酪氨酸酶属于混合抑制类型，EA主要通过疏水作用力和氢键与游离酶或酶-底物复合物进行结合，最终导致酶活性受到抑制。本研究聚焦于EA作为食品保鲜剂对蘑菇酪氨酸酶的抑制活性及分子机制，但缺乏应用可行性和安全性评估，未来需要对其进行鲜切果蔬抗褐变实验或南美白对虾保鲜实验，以评价其在食品保鲜领域中的作用功效；同时，可进行细胞水平或动物水平的安全性评价，进一步评价其应用前景。

本文《鞣花酸抑制酪氨酸酶的动力学、荧光光谱分析及分子对接》来源于《食品科学》2023年45卷第2期104-112页，作者：倪丹, 蒋新元, 唐玉莲, 等。DOI:7506/spkx1002-6630-20230411-097。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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