生物技术平台依靠模式生物来生产精细化学品和蛋白质，这些模式生物（大肠杆菌、酿酒酵母等）通常是异养生物，依赖外源碳原料。长期以来，科学家们一直在探索将异养模式生物转化为部分或完全自养生物，使其能够以CO2中的碳作为原料碳源。

实现这一目标的主要策略是使用代谢工程将CBB 循环（光合作用中的碳固定途径）的成分整合到模式生物中，然后进行适应性进化。此前，有研究人员在大肠杆菌中表达RuBisCO和磷酸核酮糖激酶 (PRK)，从而获得具有功能性 CBB 循环的半自养和自养大肠杆菌菌株；也有研究人员将 CBB 循环的成分引入酿酒酵母中，用于碳固定和提高乙醇产量。

近日，伊利诺伊大学香槟分校团队在Nature Communications上发表了题为 “Introducing carbon assimilation in yeasts using photosynthetic directed endosymbiosis” 的研究论文。这项研究通过在酵母和光合蓝藻之间设计定向内共生，将碳同化引入酿酒酵母中。具体来说，研究人员将各种蓝藻突变体设计为模型酵母S. cerevisiae内的内共生体，使得内共生蓝藻进行碳同化并向突变酵母细胞提供同化的糖以及光合作用产生的 ATP。几种由此产生的酵母/蓝藻内共生嵌合体，在不存在葡萄糖或甘油等原料碳源的情况下，仅以碳酸氢盐衍生的CO2作为碳源，能够繁殖几代。文章通讯作者Angad Mehta现为伊利偌伊大学香槟分校化学院助理教授、博士生导师。

图丨改造 Syn7942，使其分泌由CO2获得的葡萄糖（来源：Nature Communications）

在达成这一目标的过程中，研究人员首先对蓝藻Synechococcus elongatusPCC 7942 (Syn7942) 进行工程改造，使其将光合作用产生的蔗糖分解为葡萄糖和果糖，并进一步分泌葡萄糖。

图丨本文采用基于自杀质粒的策略来设计蓝藻突变体 SynYLG 菌株（来源：Nature Communications）

具体步骤包括：先构建整合质粒，表达与glf和invA基因相对应的密码子优化基因。glf和invA基因来自运动发酵单胞菌，glf基因编码一种葡萄糖促进基因，该基因充当葡萄糖转运蛋白，能够在积累时分泌葡萄糖，而invA基因编码一种细胞内转化酶，可将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。接下来，将细胞在光合蔗糖积累条件下培养。对于单独表达 Glf 蛋白的细胞，在细胞外培养基中检测到的葡萄糖水平较低，而对于同时表达 Glf 和 InvA 蛋白的细胞，在细胞外培养基中检测到的葡萄糖水平高得多。

完成这一步后，进一步改造这些蓝藻，使其表达定向内共生方法所必需的蛋白质。

综合以上工程改造工作，产生了蓝藻突变体 SynYLG6，它能够分泌葡萄糖，并在存在细胞外 ADP 的情况下表达 ATP，以及表达 SNARE 样蛋白以提高宿主细胞内蓝藻内共生体的稳定性。

接下来，研究人员开发了融合和选择条件，从而将 SynYLG6 细胞引入酵母线粒体突变体S. cerevisiae cox2-60中。S. cerevisiae cox2-60-SynYLG6 嵌合体能够在缺乏可发酵和不可发酵碳源但含有碳酸氢盐作为碳源的选择培养基中繁殖，这表明蓝藻内共生体提供的葡萄糖和 ATP 足以维持酵母/蓝藻嵌合体在这些条件下生长多代。

值得一提的是，研究人员还证明了，在工程蓝藻与酵母细胞融合后，只有经过专门改造以提供葡萄糖和 ATP 的蓝藻突变体才能在含有碳酸氢盐作为碳源的特定光合选择条件下恢复酵母突变体的生长。

研究人员通过分析这些酵母/蓝藻嵌合体在光合选择条件下的生存能力、总基因组 DNA 分析、对光合作用的依赖性、pTIRF 显微镜、荧光共聚焦显微镜和透射电子显微镜，对这些酵母/蓝藻嵌合体进行了表征。

此外，研究人员将S. cerevisiae cox2-60–SynYLG6 的酵母/蓝藻嵌合体，在含有未标记碳酸氢盐的选择条件下或含有13C标记碳酸氢盐的选择条件下繁殖三轮，使用代谢组学分析，证明了蓝藻光合作用中吸收的碳被整合到从酵母/蓝藻嵌合体中分离的代谢物中。

下一个目标是设计一项概念验证研究。具体来说，应用这种定向内共生方法，利用光合酵母/蓝藻嵌合体来生物合成天然产物。本质上是利用碳同化酵母/蓝藻嵌合体在没有葡萄糖或乙醇等原料碳源的情况下生产重要的萜类化合物或其前体。

为此，研究人员在酵母宿主菌株中设计了一条正交代谢途径，以介导单萜柠檬烯的生物合成。最后，在光合选择条件下，检测到了酵母/蓝藻嵌合体培养物中柠檬烯的形成。证明了在光合选择条件下使用定向内共生生物合成天然产物的可行性。

为了使这种定向内共生方法得到广泛应用，研究人员还开发了将标准实验室酵母菌株或为合成生物学应用而改造的酵母菌株转化为光合酵母/蓝藻嵌合体的方法。

研究人员指出，在最初的研究中，所使用的宿主细胞是线粒体突变体S. cerevisiae cox2-60。与酵母核基因组相比，编辑酵母线粒体基因组具有更大的挑战性。因此，为了使这种方法得到广泛应用，应该设计一种方法，从市售的实验室酵母菌株开始，在酵母核基因组中进行一些删除，以生成适合定向内共生的宿主菌株。

文章还指出，这些平台还可用于实验研究酵母中额外内共生体/细胞器的进化适应性，并获得对细菌内共生体转化为细胞器的分子见解。

参考文献：

1.Gao, Yl., Cournoyer, J.E., De, B.C. et al. Introducing carbon assimilation in yeasts using photosynthetic directed endosymbiosis. Nat Commun 15, 5947 (2024).

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