【写在前面】：本期推荐的是由青岛大学附属医院研究团队近期发表在Frontiers in Pharmacology(IF=4.4）的一篇文章，整合网络药理学、分子对接和实验验证，揭示青蒿琥酯抑制脉络膜黑色素瘤的作用机制。

【期刊简介】

看到有老师在后台发期刊名，是上面这个后台回复期刊名才可以查询影响因子哈！

【题目及作者信息】

Integrating network pharmacology, molecular docking and experimental verification to reveal the mechanism of artesunate in inhibiting choroidal melanoma

（图形摘要）

背景：青蒿琥酯（ART）是一种源自青蒿的天然化合物，在治疗各种肿瘤方面显示出良好的临床潜力，但确切的机制尚不清楚。脉络膜黑色素瘤 （CM） 是一种成人主要恶性眼部肿瘤，以其严重的恶性肿瘤和不良预后而闻名，在目前的治疗中疗效有限。本研究采用网络药理学、分子对接和实验验证相结合的方法，探讨了ART的抗CM作用和作用机制。

方法：在PubChem、TCMSP数据库分析平台数据库中筛选出ART的潜在靶点，从OMIM、GeneCards和DisGeNET数据库中筛选出与中药预后相关的靶基因。通过这两组数据集的交叉，得到参与CM的ART靶基因，对交叉靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，以及基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析，以确定核心靶点和关键通路。采用分子对接方法预测ART与核心靶点的结合相互作用。通过CCK8、集落形成、transwell以及流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期、活性氧（ROS）等方法评估ART对CM的影响。进行Western blot测定以研究 ART 对与 CM 相关的关键蛋白质和通路的影响。最后，进行体内试验以进一步验证ART对裸鼠皮下肿瘤的影响。

结果：研究表明，青蒿琥酯（ART）治疗中脉络膜黑色素瘤 （CM）的关键途径和核心靶点是通过网络药理学方法确定的。分子对接结果验证了ART与这些核心靶点之间的强结合亲和力。分析和预测结果表明，ART主要通过多种肿瘤相关途径（如细胞凋亡）对CM产生影响。体外试验证实，ART显著抑制CM细胞的增殖和迁移。这是通过激活 p53 信号通路促进细胞凋亡，通过抑制 PI3K/AKT/mTOR 信号通路引起细胞周期停滞在 G0/G1 期，并通过激活 NRF2/HO-1 信号通路增加细胞内 ROS 水平来实现的。此外，体内检测进一步验证了ART对CM的显著增殖抑制作用。

结论：该研究通过网络药理结合分子对接和体外/体内检测进行了初步探索，证实了ART通过促进细胞凋亡、诱导细胞周期停滞和增加细胞内ROS水平对CM具有潜在的抗癌作用。这些发现表明，抗逆转录病毒疗法对中医具有显著的治疗潜力。

【前言】

脉络膜黑色素瘤 （CM） 是一种高度恶性肿瘤，预后不良，患者的中位生存时间通常仅为 6 个月左右。目前，中医的综合临床治疗策略主要包括放疗和手术切除。然而，回顾性临床数据分析表明，现有的临床治疗方法并未显着提高中医患者的整体生存率，面临几个挑战：手术切除后严重的视力丧失或摘除术、放射治疗对周围正常组织的损伤以及免疫疗法对中医的疗效不佳。因此，中药患者预后不良、治疗方法存在瓶颈等问题，亟需进一步研究。

青蒿素因其卓越的抗疟疾特性而在疟疾预防和控制中显示出重要性和有效性，为其赢得了诺贝尔奖。近年来，越来越多的研究表明，青蒿素在癌症治疗中也具有巨大的潜力。作为青蒿素的半合成衍生物，ART已被证明在各种癌症中表现出抗癌活性。例如，ART通过抑制DNA损伤修复增强了食管癌细胞对辐射的敏感性，诱导结肠癌细胞自噬，促进化疗耐药神经母细胞瘤细胞凋亡和诱导头颈癌细胞铁死亡以克服顺铂耐药性。因此，推测ART也可能在CM中发挥抗癌作用。

作为识别药物靶点的优势工具，网络药理学越来越显示出其优势。其原理涉及整合生物信息学数据和药物数据库，以帮助识别潜在的药物靶点，预测药物-靶点的相互作用，并评估药物对疾病通路的影响，从而为发现抗癌药物提供关键见解。此外，本研究中使用的分子对接模拟是药物研究中广泛使用的分子建模技术，可以准确预测药物与潜在靶点之间的结合亲和力。

本研究采用图1所示的研究过程，利用网络药理学、分子对接和体外/体内检测，证明ART显著抑制了CM细胞的增殖和迁移。此外，研究还验证了ART的抗癌机制主要涉及促进细胞凋亡、诱导细胞周期停滞和增强细胞内ROS水平。这项研究进一步确立了抗逆转录病毒疗法作为治疗中医的新途径和方法的潜力。

【结果部分】

1. 收集中医抗逆转录病毒治疗的核心靶点，并进行GO和KEGG分析

2.分子对接

3. ART以浓度依赖性方式抑制CM细胞增殖和迁移

网络药理学分析显示，ART可能对CM有显著的抗癌作用。 因此，使用 CCK-8、菌落形成和细胞迁移测定进行了初步评估。

4.ART抑制CM中PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进细胞周期阻滞

分子对接结果表明，ART可以直接与PIK3CA（PI3K）结合口袋中的多个氨基酸残基（ARG-818和HIS-759）相互作用（图5A），显示出很强的结合亲和力。PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控增殖过程的关键通路之一，被认为是肿瘤发生的关键通路。基于这一推论，推测ART可能通过与该途径中的关键分子结合来发挥其抗增殖作用，从而抑制它。随后的WB测定证实，ART剂量依赖性地抑制该信号通路的表达（图5B）。

ART处理24 h后，流式细胞术测定显示G0/G1期CM细胞比例显着增加，S期细胞百分比下降，而G2期细胞比例保持不变。这些结果表明，ART诱导CM细胞中的G0/G1期停滞（图5C）。众所周知，主要在 G1 期起作用的细胞周期蛋白 D1 是细胞周期调节中的关键蛋白质。它存在于 G1 期早期，并与 CDK4 或 CDK6 形成复合物，促进从 G1 期向 S 期的过渡。细胞周期蛋白 E 与 CDK2 结合并激活 CDK2，而细胞周期蛋白 E-CDK2 复合物对于从 G1 期进展到 S 期至关重要。WB测定显示，ART诱导CM细胞中Cyclin D1，Cyclin E1，CDK2和CDK4的表达水平呈剂量依赖性降低（图5D）。

5.ART通过p53信号通路诱导CM凋亡

GO和KEGG分析显示，ART在CM细胞的凋亡途径中起着至关重要的作用（图2）。流式细胞术结果显示，随着ART处理浓度的增加，CM细胞的凋亡水平显着增加（图6A）。

作为一种重要的肿瘤抑制蛋白，p53可以上调促凋亡基因Bax的表达，并直接与Bcl-2等抗凋亡蛋白结合，抑制其功能，从而促进细胞凋亡，分子对接结果表明，ART与MDM2结合袋内的氨基酸残基GLN-72相互作用，表现出低结合能和最佳结合效果（图6B）。已知 MDM2 作为一种必需蛋白质，可直接与 p53 结合并促进其泛素化降解，从而维持 p53 的动态平衡。因此，可以推测ART是否通过p53相关途径诱导CM凋亡。

WB测定显示，ART处理导致CM细胞中p53和Bax的表达水平增加，而Bcl-2水平降低（图6C）。基于上述证据，可以强烈推测ART通过激活p53通路诱导细胞凋亡，从而增强促凋亡基因Bax的表达，降低抗凋亡基因Bcl-2的表达。

6.ART通过促进氧化应激和激活NRF2/HO-1信号通路抑制CM

在这项研究中，分子对接结果表明，ART可以与SRC结合口袋中的多个氨基酸残基很好地相互作用（图7A）。在一些肿瘤中，已发现SRC的激活与ROS水平的变化相吻合。

为进一步探究ART通过ROS相关途径作用于CM发挥其抗癌作用的具体机制，采用流式细胞术和荧光显微镜法测定不同浓度ART处理24 h后的细胞内ROS水平。这些发现显示，在ART治疗后，细胞内ROS水平显着增加，浓度依赖性增加（图7B，C）。此外，NAC作为一种有效的ROS清除剂，部分逆转了ART诱导的CM的增殖和集落形成（图7D，E），以及其对细胞迁移的抑制作用（图7F）。这些结果进一步证实了ART通过增加细胞内ROS水平对CM发挥了抗癌作用。

NRF2/HO-1 信号通路被认为是与氧化应激相关的重要通路。NRF2 因其重新定位到细胞核并启动其靶基因激活的能力而得到认可，其中包括 HO-1。这项研究表明，用ART处理后，CM细胞中NRF2及其下游基因HO-1的蛋白表达显著上调，随着ART浓度的增加，上调程度增加（图7G）。利用NRF2抑制剂ML385进行挽救实验，进一步证实NRF2/HO-1信号通路参与ART诱导的氧化应激过程。

WB 测定表明，与单独接受 ART 治疗的组相比，ART 和 ML385 的组合导致 NRF2 及其下游靶标 HO-1 的表达降低（图 7H）。此外，使用 DCFH-DA 探针检测细胞内 ROS 的实验表明，当 ART 与 ML385 结合使用时，与仅接受 ART 治疗的组相比，细胞内 ROS 的产生显着减少，表明细胞内氧化应激过程部分逆转（图 7I）。综上所述，上述结果证实了ART通过增加细胞内ROS水平和激活NRF2/HO-1信号通路发挥了抗癌作用。

7.ART通过促进氧化应激和激活NRF2/HO-1信号通路抑制CM

到目前为止，一系列的体外试验，证实了ART对CM有显著的抑制作用。接下来，我们研究了ART治疗在体内是否也有效。

如图所示，建立了在裸鼠中建立C918细胞衍生肿瘤模型的时间表，并进行了ART（图8A）。对裸鼠的观察表明，ART治疗组肿瘤的大小和重量均低于对照组，而各组小鼠的体重没有统计学上的显着差异，这证实了ART治疗在肿瘤生长中表现出显着的延迟，并且对裸鼠没有明显的毒性作用（图8B，作为评估增殖的重要指标，IHC测定显示，ART治疗组Ki67的表达明显高于对照组（图8D）。综上所述，上述结果进一步证实了ART对CM体内的抑制作用。

【结论】

本研究采用网络药理学、分子对接和实验验证相结合的综合方法，证实了ART对CM的显著抗癌作用可能归因于其有效抑制肿瘤发生的多种关键机制。这些发现不仅揭示了天然化合物在临床肿瘤治疗中的巨大潜力，而且为中药早期预防和控制的重大进展带来了希望。

注：本文原创表明为原创编译，非声张版权，侵删！

中医药基础科研服务：

相关咨询，加微信：1278317307。

【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。