跟着Nature学习科研实验室中如何偶联ADC|偶联|单抗|抗体|溶液|科研实验室|组分|缓冲液

ADC药物全称为抗体偶联药物（Antibody-drug conjugate, ADC），是将抗体通过偶联臂（Linker）与小分子药物（Payload）共价连接的复合物。其关键组成有三部分：单克隆抗体、Linker、Payload。

作为创新药时下最火热的赛道，ADC药物究竟有如何生成？之前分享了一篇ADC治疗T系白血病的文献，这里我们仔细看看科研中的ADC如何构建的。

【Nature】靶向TRBC1-ADC治疗T系白血病

1. 单抗纯化

抗体序列可实验室自己筛选，或来自现有专利。

小鼠 IgG2a kappa 抗 TRBC1 抗体通过 BD 表达和纯化，并储存在 PBS 的缓冲液中。

嵌合抗TRBC1抗体是通过将人IgG1 Fc片段移植到小鼠抗TRBC1可变区而产生的。

使用 ExpiCHO 细胞通过 GeneArt (Thermo Fisher Scientific) 表达嵌合抗 TRBC1 抗体（在 IgG1 重链 C 末端与 6× 组氨酸标签连接），并使用 HisTrap 柱 (Millipore Sigma) 进行纯化，然后进行分子筛层析，使用 HiLoad Superdex200 16/600 色谱柱 (Millipore Sigma)。

使用 TOSOH TSKgel G3000SWxl 柱和 50 mM 磷酸钠、300 mM 氯化钠、pH 7.0 running缓冲液通过分析尺寸排阻色谱法确认纯化嵌合抗体的生成。

将嵌合抗体储存在PBS中。

2. ADC偶联

2.1 单抗还原

使用 2.2 M 过量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP，Thermo Fisher Scientific，77720）在 37°C 下旋转 2 小时部分还原抗体，然后使用 Zeba Spin 7kDa 将缓冲液交换到 PBS 中去除 TCEP截留分子量 (MWCO) 柱。

2.2 单抗偶联

以下用于缀合的药物连接体溶液是通过将 DMSO 储备溶液中的药物连接体稀释到 10 mM 浓度的足量 DMSO 中来制备的，以使最终的缀合反应混合物为 10% 有机物和 90% 水性：SG3249 (MedChemExpress, HY-128952)和 MC-VC-PAB-MMAE（MedChemExpress，HY-15575）。将药物-接头溶液以五倍摩尔过量添加到部分还原的抗体中，并在室温下旋转孵育2小时。(可见科研中可使用现有ADC试剂构建，总体还是很简单的)

2.3 抗体药物偶联物纯度质量分析

接下来看看如何使用HPLC分析ADC的产品质量纯度和DAR等。

使用 Zeba Spin 7kDa MWCO 柱通过将缓冲液交换到 PBS 中来去除过量的未反应的药物接头。使用 Pierce BCA 蛋白测定（Thermo Fisher Scientific，23227）分析 ADC 的浓度，使用尺寸排阻色谱分析聚集，并通过高效液相色谱 (HPLC) 分析药物-抗体缀合和残留游离药物的存在。

使用 Agilent 1260 Infinity LC 系统进行 HPLC。对于分析分子筛色谱，使用 Yarra SEC-2000 柱（Phenomenex，3 μm，300 mm × 7.8 mm），在室温下以 1× PBS pH 7.2 作为流动相（0.2 ml min−1).使用重构的凝胶过滤标准品（Bio-Rad，1511901）进行 SEC 柱校准。

TSKgel Butyl-NPR 柱（Tosoh BioSciences，2.5 μm，4.6 mm × 35 mm）用于分析疏水相互作用层析，以评估抗体-药物缀合。

DAR 增加的抗体缀合物种类在 12 分钟内（0.8 ml/min）从 0% 1.5 M 硫酸铵、25 mM 磷酸钠 pH 7.0 梯度洗脱至 100% 25 mM 磷酸钠、25% 异丙醇, pH室温下为 7.0。

ADC DAR 通过取 280 nm 处每个吸光度 (A280) 峰的积分峰密度的加权平均值来估计，

其中 DARADC是 ADC 产品混合物的载药量，DAR 是 HIC 组分 i 的平均载药量，A 是组分 i 的积分面积，At是总载药量积分峰面积。

使用 Agilent Openlab CDS ChemStation 软件（Agilent）进行 HPLC 光谱分析。

2.4 抗体偶联药物蛋白质谱定性鉴定

这一步是使用赛默飞的高分辨率质谱Orbitrap对ADC完整分子的精细质谱定性、定量分析，一般的文献是没有提供这部分数据。

将未偶联的抗体和药物偶联的抗体在 PBS（pH 7.4）中稀释至 0.3 µg/ µl，并用 100 mM DTT 在 60 °C 下处理 30 分钟。将处理后的样品装入96孔板中。使用 HPLC（Vanquish，Thermo Fisher Scientific）以 10 分钟梯度从 15% 至 55% CAN 以及分析柱（MAbPac 反相 HPLC 柱，Thermo Fisher Scientific）分离样品中的重链和轻链。通过质谱分析这些级分以量化 DAR。Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪（Thermo Fisher Scientific）用于收集实验数据。对 m/z 谱进行解卷积后，进一步分析计算峰面积。最后，可根据质谱峰面积计算 DAR 值。