撰文 | 菠萝西瓜
杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD） 是由编码肌营养不良蛋白 （dystrophin，也被成为抗肌萎缩蛋白） 的基因DMD （该基因长约220万bp） 发生功能丧失突变引起的，是人类最常见的遗传疾病之一。在肌肉中，肌营养不良蛋白为427 kDa的蛋白质，在保护细胞免受机械应力方面起着关键作用，它还通过为多种蛋白质提供支架来调节多种细胞内信号通路。肌营养不良蛋白的缺失会导致坏死和再生的循环、进行性肌肉萎缩、炎症浸润并最终导致心脏和呼吸衰竭。为了开发针对DMD的基因疗法，之前已经开发了“微抗肌萎缩蛋白” （µDys） 版本，其小到可以通过腺相关病毒 （AAV） 载体递送。但是，这些微蛋白 （约占全长肌营养不良蛋白的33%） 缺乏关键的功能域，在动物模型和患者中表现出不完全的表型回复。由此表明，表达更长即功能更完善的较大或全长肌营养不良蛋白可以带来更好的疗效。
近日，来自美国华盛顿大学医学院的Jeffrey S. Chamberlain教授在Nature杂志上发表文章Split intein-mediated protein trans-splicing to express large dystrophins。在该研究中，研究团队开发了一种利用分裂内含肽（split intein）介导的蛋白质反式剪接机制来表达大型肌营养不良蛋白的新方法。该方法可以有效连接两或三个片段以生成较大或全长肌营养不良蛋白。通过低剂量的两或三个靶向性AAV递送到肌营养不良小鼠体内，可实现大型肌营养不良蛋白的强效表达，且较微型肌营养不良蛋白表现更显著的生理改善。
依据最新的研究，目前已经鉴定出了30多种分裂内含肽。然而，大多数研究都是对纯化的蛋白质进行的，因此很难推断其在体内的应用。另一个需要注意的问题是，所有内含肽都高度依赖于天然外显肽 （宿主蛋白） 中发现的相邻残基来催化最终的连接。这些残基由外显肽N端和C端的最后一个和第一个三肽序列一致定义。要使用蛋白质反式剪接 （protein trans-splicing） 过程重建任何感兴趣的蛋白质，这六个残基必须包含在外显肽/内含肽边界内，并作为“足迹”留下，这可能会改变蛋白质的功能。
由此，研究团队生成了一个分裂内含肽的筛选文库，并利用一种分裂绿色荧光蛋白 （GFP） 系统来对不同的分裂内含肽对进行多步骤筛选与评估。通过综合考虑分裂内含肽的有效率、特异性和“足迹”的多少，gp41.1、IMPDH和Nrdj1三个分裂内含肽被成功筛选获得。随后，利用gp41.1分裂内含肽在HEK293细胞内表达较大肌营养不良蛋白midi-Dys （∆SR5-15） 的N端与C端，结果显示gp41.1分裂内含肽可以将其N端与C端剪接在一起，高效表达出较大肌营养不良蛋白midi-Dys （∆SR5-15） 。
紧接着，研究团队分别利用IMPDH和gp41.1、Nrdj1和gp41.1两对分裂内含肽各自完成N端、中间段和C端肌营养不良蛋白的全长组装，结果显示可以成功组装出全长肌营养不良蛋白。
为了在体内验证可行性，将每种组合的分裂抗肌营养不良蛋白/内含肽克隆到肌肉特异性增强子/启动子CK8e下游，并包装到AAV6载体中，且以1:1或1:1:1的比例将5×1010 个不同对的病毒基因组 （vg） 注射到3周龄抗肌营养不良蛋白缺陷型mdx4cv雄性的胫骨前肌中。随后通过蛋白印迹和荧光手段发现小鼠肌肉中均表达出较大或全长版本的肌营养不良蛋白。
鉴于全身型给药的多种不足，为了提高靶向性，研究团队选用肌向性衣壳AAVMYO实现基因递送。由此，研究团队使用低剂量2×1013 （总计） vg kg−1和高剂量2×1014 （总计） vg kg−1的AAVMYO比较了单 （µDys） 和双 （midi-Dys） 载体策略。将AAV颗粒注入8周龄、年轻成年mdx4cv雄性的尾静脉中。结果显示双（ midi-Dys） 载体正常表达肌营养不良蛋白，且其肌肉性能改善较µDys更好。类似的，将该体系导入至年老的小鼠模型中也展现类似的效果，且可以部分降低纤维化水平。
本研究数据显示，表达较大或全长肌营养不良蛋白的功能明显优于正在临床试验中测试的微型肌营养不良蛋白。这种方法可以使许多患有杜氏肌营养不良症或贝克尔肌营养不良症的患者受益，也为其他疾病提供了治疗思路。
https://doi.org/10.1038/s41586-024-07710-8
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