本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。
Abstract
微酸性电解水（SAEW）已被证明是食品和农业领域的一种高效和新型的消毒剂。本研究评估了SAEW（30 mg/L）在40 °C下灭活食源性病原体和分离多重耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）生物膜的功效。此外，研究了40 °C加热SAEW处理下MRSA生物膜对代谢谱的潜在机制。结果表明，在40 °C下加热的SAEW对猪肉、鸡肉、菠菜和生菜的食源性病原体减少了1.96～7.56（lg（CFU/g））。在40 °C处理下加热的SAEW显著减少了2.41（lg（CFU/cm2））。SAEW处理的协同作用在降低细胞密度和损害生物膜细胞膜方面显示出强烈的抗生物膜活性。在40 °C下通过SAEW处理的MRSA生物膜的整体代谢反应揭示了细胞内代谢物的改变，包括氨基酸，有机酸，脂肪酸和脂质。此外，参与氨基酸代谢、能量代谢、核苷酸合成、碳水化合物代谢物和脂质生物合成的信号通路在40 °C处理下被SAEW在功能上破坏。
Introduction
近年来，抗微生物药物耐药性已成为世界上最关键和最严重的问题，危及食品安全和公众健康。多重耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种机会性病原体和生物膜生产者，可获得多种耐药基因。世界卫生组织最近将MRSA列为高度优先的抗生素耐药性病原。此外，众所周知，金黄色葡萄球菌会在非生物和生物表面上形成生物膜，从而对各种抗菌剂、恶劣的环境条件和宿主免疫力具有相当大的抵抗力。先前的报告显示，64.8%的金黄色葡萄球菌分离菌株表现出高生物膜形成，90.3%对至少一种抗菌剂具有耐药性。更重要的是，生物膜生长可以极大地刺激金黄色葡萄球菌的自发突变，并通过水平基因转移增强获得或传播抗菌素耐药性决定簇的能力。MRSA引起的污染和感染难以治疗，主要是由于抗生素耐药性和消毒剂对MRSA生物膜基质的渗透有限。它们与食品接触表面和特定食品（如即食产品、水果和蔬菜）的交叉污染有关，增加了公众对健康的关注。因此，开发创新的抗MRSA生物膜策略至关重要。
在食品和农业领域，微酸性电解水（SAEW）已被证明是一种高效且新颖的消毒剂。当稀释的电解质（包括HCl和/或NaCl）在没有隔膜的电解槽中电解时，会产生一种称为SAEW的溶液。SAEW产生的次氯酸（HOCl）的灭活效果是等量次氯酸离子（ClO−）灭活食源性病原体的80倍，包括肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌。商业生产的SAEW具有低成本、易于使用和环保的额外优势，在食品行业越来越受欢迎。研究人员发现，各种关键反应参数，如电极材料、水硬度和电解质组成，都显著影响了这种氧化剂（Cl2、ClO−和HOCl）。影响所生产氧化剂的产量和种类的基本关键参数之一是电极材料。在电解过程中，钌（Ru）、铱（Ir）和铂（Pt）作为铂族金属（PGM）在电极上使用的催化剂可以通过降低氯离子的氧化还原电位来增加氯的产生。然而，通过优化电极材料的类型和形状来开发高效的SAEW发生器的研究很少。
此外，为了增强SAEW的抗菌活性，研究人员使用跨栏技术将SAEW与温和的热量，有机酸，紫外线和超声波相结合。据推测，与单独使用冷水相比，使用热水与SAEW联合处理的跨栏技术将有助于减少微生物负荷。然而，通常期望产生 SAEW，然后将其加热到目标温度以进行确切性质的研究。加热SAEW对MRSA生物膜机制的影响仍未得到很好的探索。
代谢组学可以跟踪细胞的整体环境应激结果。最近几天，细胞代谢组学可能通过分析整个代谢物库来揭示细菌如何应对压力。质谱（MS）已成为代谢分析的重要工具，使细菌代谢状态的高通量图谱更加可能，并全面了解氧化应激的潜在机制并确保细菌反应。因此，用SAEW和预热联合处理处理的MRSA生物膜的综合代谢组学可以提供有关适应性过程的宝贵信息。
因此，本研究的目的是：1）优化SAEW生成系统，包括电极材料和温度变化以及SAEW的稳定性和抗菌效果；2）评估SAEW和预热对生物膜细胞失活和MRSA生物膜脱落的协同影响；3）研究MRSA生物膜响应SAEW和预热处理的代谢变化和分布途径。
Results and Discussion
电极材料对电解过程中活性氧产生的影响
制备过程，包括电极材料，已被证明会影响SAEW性能。Pt、Ru和Ir被认为在SAEW生产过程中保持稳定的性能。电解质的浓度也会影响SAEW的有效性。因此，分别测试了使用Pt、Ru或Ir添加不同浓度HCl（1%、1.5%和2%）和NaCl（0、1、2和3 mol/L）的SAEW的生产效果，如表1所示。结果表明，ACC浓度随电解液浓度的增加而增加。这可能是由于电解质浓度较高导致电导率较高，从而产生更多的氯。值得注意的是，使用含有3 mol/L NaCl和1.5% HCl的Ru板样品生成了具有较高ACC（26 mg/L）和适当pH值（5.91）的可接受SAEW。
既往研究表明，活性氯的合成是金属氧化物电极表面氯离子的直接氧化[2Cl–－2e–＝Cl2 (g)]，其次是生产HOCl（Cl2＋H2O → HOCl＋H+＋Cl–)。因此，阳极的氧化性能对于发电系统在电解反应中的效率至关重要。Ru、Ir和Pt属于铂族金属。根据三种材料的结构特点，Ir的最外层有两个电子，而Pt和Ru的最外层只有一个电子。最有效的电导体是具有单价电子的金属，它可以自由移动并加速电解过程中的离子交换。
表1 电解质材料对电解水pH值和ACC的影响
轻度加热SAEW对消毒效果的协同作用
众所周知，加热可以提高SAEW的消毒效果。然而，相关研究通常首先产生SAEW，然后将其加热到所需温度。这意味着保鲜障碍技术包含两种工艺，在食品工业中的应用既无效又不方便。因此，本研究开发了一步加热SAEW系统。图1和图2描述了由Ru电极材料产生的温和加热SAEW的特性和抗菌功效。SAEW的物理性质（pH和ACC）在预热温度变化中没有显著差异。当SAEW在生产后加热到50 °C时，ACC没有损失。
大肠杆菌、肠链球菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌13565和MRSA处理的自来水在30、40和50 °C下的存活率与对照组相比无统计学意义。相比之下，在30、40和50 °C下温和加热的SAEW在处理1 min后将大肠杆菌、肠链球菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌13565降低到未检测到的水平。在30 °C（减少4.49（lg（CFU/mL））、40 °C（减少5.65（lg（CFU/mL））和50 °C（减少6.71（lg （CFU/mL）下温和加热SAEW对MRSA的消毒效果大于室温下的SAEW（减少1.54（lg（CFU/mL））。因此，轻度加热SAEW的跨栏技术显示出协同杀菌效果。
考虑到样品上不同的细胞附着水平和有机物，还评估了加热SAEW对人工接种在食品样品上的病原体灭活的影响。在不同温度下用SAEW处理导致分别接种在生菜、菠菜、鸡肉和猪肉上的单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、肠炎链球菌和金黄色葡萄球菌分别减少5.14～7.16、4.88～7.56、0.67～3.14和0.76～2.55（lg（CFU/g）。SAEW的消毒功效排名如下：室温＞50 °C＞40 °C＞30 °C。此外，与对照组相比，在40 °C下用SAEW洗涤后猪肉和鸡肉的整体外观没有显著差异（图3）。总体而言，对食品样品进行消毒的最有效干预措施应是在40 °C下使用温和加热的SAEW。
图1 使用生成过程中水温变化优化SAEW的物理特性
图2 （A）加热SAEW随温度变化对抗菌效果的影响；（B）SAEW对人为接种的食品样品病原体的灭活作用
图3 与对照组（蒸馏水）相比，在室温、30、40和50 °C下通过SAEW洗涤后的鸡肉、猪肉、生菜和菠菜的一般外观
40 °C轻度加热SAEW对多重耐药金黄色葡萄球菌生物膜的协同作用
食源性致病菌在食品接触表面形成的生物膜在食品加工过程中导致交叉污染，这是食品工业中一个严重的问题。金黄色葡萄球菌是一种适应性很强的病原体，具有在固相表面形成生物膜的显著倾向，特别是在食品设备上。不锈钢广泛用于食品加工厂的食品接触表面。因此，研究了40 °C下SAEW、加热和温和加热SAEW对304不锈钢上两种金黄色葡萄球菌菌株的抗生物膜功效。
根据图4中的结果，生物膜生物量表明，在40 °C下温和加热的SAEW可以更有效地根除MRSA（41.23%还原率）和金黄色葡萄球菌13565生物膜（57.72%还原率）。值得注意的是，在温和加热的SAEW处理下，金黄色葡萄球菌13565生物膜比MRSA生物膜更易感。这可能是因为金黄色葡萄球菌13565具有较强的生物膜生成表型，而MRSA具有较强的抗性，而生物膜生成较弱。同时，个别温和的热水处理并不能有效地灭活MRSA和金黄色葡萄球菌生物膜细胞。DW在40 °C下单独5 min仅产生0.46和0.32（lg（CFU/cm2）），分别是MRSA和金黄色葡萄球菌生物膜细胞。单独用SAEW处理5 min分别在MRSA和金黄色葡萄球菌生物膜细胞中灭活1.55和1.87（lg（CFU/cm2））。因此，在40 °C下加热SAEW的巨大潜力是减少病原微生物生物膜中活细胞的有前途的策略。
基于CLSM的SAEW结合预热对生物膜的观察
CLSM揭示了40 °C温和加热SAEW对MRSA和金黄色葡萄球菌13565成熟生物膜细胞膜通透性的影响。如图5所示，对照MRSA和金黄色葡萄球菌生物膜细胞发出绿色荧光，表明所有生物膜细胞都粘附在人口稠密区域的不锈钢表面，没有膜损伤。然而，在40 °C下温和加热SAEW处理后，两种生物膜细胞发出红色荧光的比例急剧增加。这一发现表明，在40 °C下加热的SAEW显著增加了受损细胞的数量。此外，表2显示了从CLSM图像确定的未经处理和处理的MRSA和金黄色葡萄球菌生物膜的观察到的关键参数。联合处理在减少平均厚度（MRSA从16.55到3.10 μm，金黄色葡萄球菌从16.82到4.35 μm）和生物量生物量（从5.73到3.46 μm）方面表现最好。这些事件归因于生物膜基本结构的破坏，当在40 °C下通过温和加热的SAEW处理时，导致更多的微孔。
图5 通过SAEW（30 mg/L）和加热（40 °C）组合处理的金黄色葡萄球菌生物膜的共聚焦激光扫描显微镜图像
表2 SAEW联合预热处理处理的MRSA和金黄色葡萄球菌13565生物膜平均厚度、粗糙度和孔隙率的变化
代谢组学分析和通路分析
研究了代谢物谱，以探索生物膜氧化和热响应变化的潜在机制。采用UPLC-QTOF-MS/MS研究了暴露于轻度加热SAEW处理的两种金黄色葡萄球菌生物膜的总体代谢反应。迄今为止，这是第一项评估代谢物谱和途径的研究，以研究MRSA和金黄色葡萄球菌生物膜的氧化反应。
在40 °C处理生物膜细胞下对SAEW，加热和加热SAEW的代谢分析显示，MRSA和金黄色葡萄球菌13565菌株生物膜中的各种代谢物都发生了改变。MRSA中25种细胞内代谢物的含量发生了变化，而金黄色葡萄球菌13565中32种代谢物的水平发生了变化，包括有机酸、氨基酸、脂肪酸、寡肽、碳水化合物、氨基酸赖氨酸的类似物、肽和其他衍生物（图6和图7）。分析表明，加热SAEW对MRSA和金黄色葡萄球菌13565的生化水平影响不同。具体而言，在金黄色葡萄球菌13565生物膜上，L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、谷氨酸和L-色氨酸等4种显著改变的氨基酸下降，而MRSA中只有3种氨基酸发生改变。在40 °C处理下，MRSA中谷氨酸、L-亮氨酸和L-色氨酸的积累量分别比金黄色葡萄球菌13565低2倍、8倍和2倍。此外，金黄色葡萄球菌13565生物膜的乙酸和琥珀酸含量显著降低 。 葡萄糖和果糖在MRSA中的强度低于13565的金黄色葡萄球菌。
基于比较文献和KEGG，构建了一个假设的代谢图，以显示金黄色葡萄球菌13565和MRSA在40 °C处理下SAEW，加热和加热SAEW的反应（图8）。在加热SAEW处理中，热增强了SAEW的抗生物膜作用，这可能是由于SAEW的ClO促进了生物膜结构的渗透和扩散。
最初，金黄色葡萄球菌13565和MRSA必须在宿主入侵期间快速适应各种碳和氮源。葡萄糖通常被认为是细胞能量的主要来源，可用于能量产生和生物合成途径。糖酵解作为葡萄糖分解代谢途径，代谢葡萄糖，提供果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸等生物合成前体，并迅速产生少量NADH、ATP，丙酮酸可进入克雷布斯循环（TCA）。必需前体的减少可能是由于代谢系统的紊乱。在金黄色葡萄球菌13565和MRSA生物膜细胞中，TCA相关代谢物（如琥珀酸）减少。
TCA循环为其他代谢途径提供中间体和前体，并由其他代谢物提供。γ-氨基丁酸（GABA）可由L-谷氨酸合成，并进一步调节参与TCA循环的琥珀酸。谷氨酰胺由氮代谢合成，氮代谢以铵作为氮供应催化谷氨酸的ATP依赖性酰胺化。它可用于生产琥珀酸酯，以维持TCA循环。因此，一种代谢途径的中断可能会影响整个代谢系统。
图6 （A）未经处理的对照、室温下的SAEW、40 °C的自来水以及SAEW和40 °C预热联合处理下的MRSA生物膜中25种已鉴定代谢物的热图；（B）通过比较PC1和PC2，显示了未经处理的对照、室温下SAEW、40 °C自来水以及SAEW和40 °C预热联合处理下MRSA生物膜的PCA；（C）对照与联合处理中MRSA生物膜的KEGG通路分析
图7 （A）未经处理的对照下金黄色葡萄球菌ATCC 13565生物膜中32种已鉴定代谢物的热图，室温下SAEW、40 °C自来水、SAEW和40 °C预热联合处理；（B）未处理对照下金黄色葡萄球菌ATCC 13565生物膜的PCA，室温下SAEW、40 °C自来水，通过比较PC1和PC2，显示了SAEW和40 °C预热的组合处理；（C）对照组中金黄色葡萄球菌ATCC 13565生物膜的KEGG通路分析与对照组的KEGG通路分析
Conclusion
本研究评估了SAEW和预热联合处理对MRSA生物膜的协同效应。SAEW（30 mg/L）或预热（40 °C）的5 min处理对MRSA生物膜没有显著的杀菌影响。Ru-plate材料产生的SAEW（30 mg/L）与40 °C预热的组合协同减少了亚致死细胞的数量，并有效地分离了MRSA生物膜。联合处理显著使金黄色葡萄球菌生物膜细胞减少2.41～3.49（lg（CFU/cm2））。当联合SAEW和预热进行5 min时，生物膜基本结构的破坏导致整个完整的表面和更多的孔。此外，代谢组学分析表明，细胞内代谢物在生物膜中的含量发生了改变，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸和脂质。MRSA和金黄色葡萄球菌13565的显著改变途径数量分别为4和8。金黄色葡萄球菌13565生物膜在联合处理下更易受到MRSA生物膜的影响。
Structural insights on anti-biofilm mechanism of heated slightly acidic electrolyzed water technology against multi-resistant Staphylococcus aureus biofilm on food contact surface
Pianpian Yana, Ramachandran Chelliaha,b,c, Kyoung Hee Joa, Xiuqin Chena, Akanksha Tyagia, Hyeon Yeong Jod, Fazle Elahia, Nam Chan Wood, Min Seung Wookd, Deog Hwan Oha,*
a Department of Food Science and Biotechnology, College of Agriculture and Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, South Korea
b Kangwon Institute ofInclusive Technology (KIIT), Kangwon National University, Chuncheon 24341, South Korea
c Saveetha School of Engineering, (SIMATS) University, Sriperumbudur 600124, India
d Seoulin Bioscience Company, Seongnam-si 13488, South Korea
*Corresponding author.
Abstract
Slightly acidic electrolyzed water (SAEW) has proven to be an efficient and novel sanitizer in food and agriculture field. This study assessed the efficacy of SAEW (30 mg/L) at 40 ℃ on the inactivation of foodborne pathogens and detachment of multi-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) biofilm. Furthermore, the underlying mechanism of MRSA biofilm under heated SAEW at 40 ℃ treatment on metabolic profiles was investigated. The results showed that the heated SAEW at 40 ℃ significantly effectively against foodborne pathogens of 1.96–7.56 (lg (CFU/g)) reduction in pork, chicken, spinach, and lettuce. The heated SAEW at 40 ℃ treatment significantly reduced MRSA biofilm cells by 2.41 (lg (CFU/cm2)). The synergistic effect of SAEW treatment showed intense anti-biofilm activity in decreasing cell density and impairing biofilm cell membranes. Global metabolic response of MRSA biofilms, treated by SAEW at 40 ℃, revealed the alterations of intracellular metabolites, including amino acids, organic acid, fatty acid, and lipid. Moreover, signaling pathways involved in amino acid metabolism, energy metabolism, nucleotide synthesis, carbohydrate metabolites, and lipid biosynthesis were functionally disrupted by the SAEW at 40 ℃ treatment. As per our knowledge, this is the first research to uncover the potential mechanism of heated SAEW treatment against MRSA biofilm on food contact surface.
Reference:
YAN P P, CHELLIAH R, JO K H, et al. Structural insights on anti-biofilm mechanism of heated slightly acidic electrolyzed water technology against multi-resistant Staphylococcus aureus biofilm on food contact surface[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(3): 1556-1566. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250131.
翻译：林安琪（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与陕西师范大学、新疆农业大学、浙江海洋大学、甘肃农业大学、大连民族大学、西北大学于2024年10月14-15日在陕西西安共同举办“2024年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。
长按或微信扫码了解详情
为加强企业主导的产学研深度融合，促进食品科研成果转化和服务地方经济产业，由全国糖酒会主办，北京食品科学研究院、中国食品杂志社和中粮会展（北京）有限公司承办的“食品科技成果交流会”将于2024年10月29-31日糖酒会期间在深圳国际会展中心举办 ，以当前食品科技发展趋势和食品产业发展的重点科技需求为导向，针对食品产业发展面临的重大科技问题，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。
长按或微信扫码进行注册
会议招商招展
联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）
热门跟贴