中风后脑损伤的神经炎症反应涉及多种细胞类型和分子机制，包括小胶质细胞、星形胶质细胞、T细胞、B细胞和中性粒细胞等。这些细胞通过释放炎症因子、激活免疫受体、参与血脑屏障的破坏和修复等途径，共同影响中风后的脑损伤和修复过程。中风后发生于几分钟至几小时内的神经炎症和免疫反应与急性缺血性中风（AIS）后的脑损伤有关。PPARγ共激活因子-1α（PGC-1α）作为线粒体生物发生中基因表达的主要协同调节因子，AIS后在小胶质细胞中上调。然而，小胶质细胞PGC-1α在中风后免疫调节中的作用尚不清楚。
基于此，首都医科大学宣武医院神经内科郝峻巍研究团队在Genome Medicine杂志发表了“Microglial PGC-1α protects against ischemic brain injury by suppressing neuroinflammation”揭示了小胶质细胞PGC-1α通过抑制神经炎症来保护大脑免受缺血性损伤。
作者首先评估了人和小鼠脑样本中AIS后小胶质细胞PGC-1α的表达。随后使用特异性过表达PGC-1α的小胶质细胞的转基因小鼠进行中脑动脉闭塞（MCAO）模型，评估了PGC-1α过表达的小胶质细胞的形态和基因表达谱。缺血性中风后，PGC-1α表达在人和小鼠的脑组织中短暂增加。过表达 PGC-1α的小胶质细胞特异性小鼠表现出减少的神经功能缺陷，这与减少的炎症反应有关。ChIP-Seq和KEGG通路分析显示PGC-1α可以显著促进自噬作用，特别是线粒体自噬。ULK1是自噬作用的关键调节因子，其抑制或敲低会损害自噬/线粒体自噬活性，从而消除PGC-1α的神经保护效果。
图一 缺血性中风后，PGC-1α的表达呈现时间依赖性波动
PGC-1α在AIS后小胶质细胞中的作用仍然不清楚。作者首先评估了来自缺血性中风患者的尸检大脑样本中PGC-1α的水平，发现PGC-1α的表达在AIS后的不同时间点发生了变化。相对荧光强度分析显示，与非神经系统疾病的对照组相比，中风发作后第1天的小胶质细胞中PGC-1α表达增加，但在中风发作后第3至10天去世的患者中减少。相应地，小鼠小胶质细胞中PGC-1α的mRNA和蛋白水平也在第1天达到峰值，但在tMCAO后的第3至7天逐渐下降。表明在tMCAO模型中，小胶质细胞中的PGC-1α表达以时间依赖性方式发生了变化。此外，还确定了AIS患者和鼠神经元和星形胶质细胞中PGC-1α的水平，并发现PGC-1α在AIS后第1天在神经元和星形胶质细胞中均被下调。小胶质细胞中的PGC-1α可能参与了AIS的病理生理过程。
图二 小胶质细胞特异性诱导性过表达PGC-1α
为了进一步确定PGC-1α在小胶质细胞中的作用，作者通过遗传操作在小胶质细胞中条件性过表达了PGC-1α。为此，生成PGC-1αf/f Cx3cr1-Cre/ER（mPGC-1α）小鼠的基因靶向策略。在TAM诱导后30天，将杂交小鼠用于tMCAO模型实验。mPGC-1α小鼠中的PGC-1α表达大约是PGC-1αf/f小鼠的两倍。使用Iba-1、GFAP和NeuN对eGFP进行免疫荧光染色证明PGC-1α在来自mPGC-1α小鼠的小胶质细胞中特异性过表达。qRT-PCR分析证实小胶质细胞中的PGC-1α mRNA表达增加了约2倍。与PGC-1αf/f对照组相比，mPGC-1α小鼠的脾脏、肝脏、肾脏、心脏和肺组织中的PGC-1α mRNA表达没有明显差异。这些结果表明mPGC-1α小鼠的小胶质细胞特异性过表达PGC-1α。为了探究小胶质细胞PGC-1α过表达对缺血性脑损伤的影响，mPGC-1α转基因小鼠和PGC-1αf/f小鼠的同窝对照鼠在TAM处理后接受了tMCAO手术。随后在tMCAO后的第1天、第3天和第7天进行了多种神经行为测试。为了排除这两组小鼠在tMCAO手术期间血管阻塞的变异，使用激光散斑血流成像（一种非侵入性的光学成像技术，用于实时监测和量化组织中的血流变化。这种方法特别适用于研究大脑血流动力学）检测了rCBF，两组在基线、缺血或再灌注期间的rCBF没有显著差异。
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有趣的是，mPGC-1α小鼠在tMCAO后的死亡率显著低于同窝对照。与PGC-1αf/f小鼠相比，mPGC-1α小鼠的神经学评分明显降低。转棒测试显示，mPGC-1α小鼠比PGC-1αf/f小鼠具有更好的运动和感觉功能以及更好的平衡技能。TTC染色的脑切片显示，与PGC-1αf/f小鼠相比，mPGC-1α小鼠的梗死体积减少。小胶质细胞PGC-1α敲除在急性阶段加重了中风的严重程度。与PGC-1αf/f小鼠相比，mPGC-1α小鼠在tMCAO后第14天的临床评分更好，这表明小胶质细胞PGC-1α可能对缺血性脑损伤中的神经恢复有潜在的神经保护作用。作者从1天的PGC-1αf/f和mPGC-1α小鼠中分离出原代小胶质细胞和神经元。在炎症刺激后，发现与来自mPGC-1α小鼠的小胶质细胞共培养的神经元在炎症条件下显示出明显减少的神经元凋亡，并且这些神经元具有正常外观的轴突和树突，表明小胶质细胞中PGC-1α的过表达影响与神经元的相互作用并保护神经元免受炎症侵害。这些数据共表明，小胶质细胞特异性PGC-1α过表达在限制缺血引起的脑损伤中发挥关键作用。
图三 PGC-1α通过抑制NLRP3的过度激活来减轻神经炎症
为了探究PGC-1α在中枢神经系统炎症反应中的作用，研究人员首先利用蛋白质组学分析方法量化了小胶质细胞中的40种细胞因子/趋化因子。结果发现，包括CCL5、IL-6、IL-17和TNF-α在内的许多促炎细胞因子，在PGC-1α过表达的小鼠（mPGC-1α）的小胶质细胞中相比PGC-1αf/f小鼠有所下降。此外，IL-1β在mPGC-1α小鼠中也明显减少。研究人员进一步检测了IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，结果与蛋白质组学分析一致，这些细胞因子在mPGC-1α小鼠的小胶质细胞中均有所降低。先前的研究表明NLRP3炎症体在放大炎症反应中发挥关键作用。流式细胞分析显示，mPGC-1α小鼠的小胶质细胞中NLRP3的激活同样受到了抑制。在体外实验中，研究人员检测了过表达PGC-1α的BV2细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，并发现这些细胞因子的水平有所下降，同时NLRP3、ASC和pro-IL-1β的表达也减少。通过基因表达分析，还评估了LPS刺激后BV2细胞和PGC-1α过表达的BV2细胞的基因表达谱，结果表明PGC-1α改变了BV2细胞中与代谢和炎症相关的基因。进一步的实验评估了PGC-1α对BV2细胞炎症因子产生和炎症体激活的影响，结果表明，在LPS刺激后，与BV2细胞相比，PGC-1α过表达的BV2细胞炎症反应减少。这些数据表明，PGC-1α能够抑制NLRP3的激活，并随后减少促炎细胞因子的产生。PGC-1α通过与转录因子ERRα协同调控自噬诱导激酶ULK1的表达，影响小胶质细胞内自噬和线粒体自噬过程，进而减少活性氧产生及NLRP3炎性小体的激活，抑制小胶质细胞介导的神经炎症反应。
图四 PGC-1α在小胶质细胞中促进自噬和线粒体自噬活性
在缺血性压力下，受损线粒体的自噬清除对维持线粒体稳态至关重要。作者通过WB检测微管相关蛋白1轻链3（MAP1LC3，自噬体形成的标志物）的表达，在过表达PGC-1α的BV2细胞中发现其表达上调。此外，评估了PGC-1α对小胶质细胞自噬通量的影响。发现PGC-1α诱导后LC3-II的表达增强，并且经BAF处理后表达进一步增加。而且，自噬生物标志物SQSTM1（LC3-II结合的生物标志物）在PGC-1α过表达的BV2细胞中显著减少。BAF处理促进了SQSTM1的积累，从而表明PGC-1α促进了自噬通量。OGD处理后，PGC-1α过表达组中自噬体和自溶酶体的数量增加。PGC-1α过表达细胞的自噬通量率也增加。作者还进一步监测了线粒体自噬活性，在过表达PGC-1α的BV2细胞中观察到线粒体自噬的激活。OGD处理后线粒体自噬体的数量增加，PGC-1α过表达增强了线粒体自噬体的形成。然而，降低PGC-1α表达减弱了线粒体自噬体的形成。使用透射电子显微镜（TEM）进一步评估了线粒体的结构，显示PGC-1α过表达的BV2细胞中形成了更多的线粒体溶酶体，表明PGC-1α促进了线粒体自噬从自噬体到溶酶体的进展。PGC-1α的敲低减少了线粒体溶酶体的数量。这些结果表明PGC-1α也促进了线粒体自噬从自噬体到溶酶体的进展。
总结
作者的结果表明小胶质细胞中的PGC-1α在通过调节自噬和线粒体自噬以及抑制神经炎症来保护大脑免受缺血性损伤方面发挥着关键作用。
文章来源
https://doi.org/10.1186/s13073-021-00863-5
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