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双光子显微镜活体观察小鼠脊髓固定系统的建立

麻醉小鼠，将其放置于脊髓活体成像固定仪上，背部剔毛、聚维酮碘消毒背侧皮肤后置于无菌操作台上。手术显微镜下正中切口切开背侧皮肤，剥离脊柱两侧肌肉，暴露椎板。用显微剪刀打开L1椎板，暴露脊髓，保持硬脊膜完整7。用脊柱固定器牢固固定脊柱两侧，并将小鼠脊柱稍微悬吊起来，使小鼠躯干与固定仪底面留有一定空间，降低小鼠自身呼吸与心跳对扫描成像带来的干扰。将2%琼脂溶液覆盖于暴露的脊髓周围，形成一个局部“储水池”，有利于物镜的成像与控制脊髓局部的微动，罗丹明染料尾静脉注射标记血管。使用双光子显微镜的荧光镜观察损伤区域与其血管走行，作为每次激光扫描前定位的标志。再使用双光子显微镜20倍水镜与920nm激光波长进行活体成像，逐层扫描脊髓神经纤维。成像完毕后，将小鼠从固定仪上取出，脊髓局部使用2%琼脂覆盖保护，逐层缝合肌肉与皮肤,术后使用青霉素预防感染。

Fig1 双光子脊髓活体成像图像

压迫性脊髓损伤模型的建立

麻醉动物，聚维酮碘消毒背侧皮肤后置于无菌操作台上。手术显微镜下打开L1椎板，暴露脊髓，保持硬脊膜完整。使用脊髓活体成像固定仪固定脊柱两侧，在立体定位仪引导下，以挤压重量为20g、底面大小为2mm×1mm的压杆垂直向下压迫脊髓，压迫深度为（2.0±0.1）mm，5min后除去挤压力，可见小鼠双侧后肢抽动、甩尾，随后完全松弛，提示脊髓损伤模型建立成功。术后逐层缝合肌肉与皮肤，将小鼠放入恒温箱中直至清醒。术后小鼠每日人工辅助排尿2次，1周内每日使用青霉素1次预防感染。运动功能评定术后采用随机双盲对照试验观察各组小鼠后肢运动功能情况；并于术后1~7d每天采用后肢运动功能（MouseScale，BMS）评分法进行运动功能评定，小鼠双下肢无运动功能异常为9分，双下肢完全丧失运动功能为0分。

文献引用：

  • 张逸凌. 运用双光子显微镜观察甲泼尼龙对小鼠脊髓损伤的实验研究[D].中国人民解放军医学院,2015.

  • Changes in the Use of the Methylprednisolone Protocol for Traumatic Spinal Cord Injury in Switzerland[J]. Peter Felleiter;;Nicole Müller;;Frederik Schumann;;Olga Felix;;Peter Lierz.Spine,2012(11)

  • Changes of intracellular calcium and the correlation with functional damage of the spinal cord after spinal cord injury[J]. 章亚东 ,侯树勋 ,吴叶.Chinese Journal of Traumatology,2002(01)

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